哈尔滨地区鸡球虫种类调查及柔嫩艾美耳球虫3-1E基因的原核表达

摘要

鸡球虫病是造成当今世界养鸡业各种损失的主要原因之一。其危害很大，轻则造成鸡的生长发育受阻、生产性能下降。重则造成鸡的大批死亡，尤其是鸡雏阶段，15～50日龄的鸡雏发病率高，死亡率高达80％。随着集约化养殖业的发展和鸡对化学疗法抵抗力的增强以及虫株耐药性和药物的污染等，致使本病的危害日趋严重，因此，做好鸡球虫流行病学调查对于该病的防治具有重要的意义。
　　 鉴于此，本研究对哈尔滨地区鸡球虫的病原的种类及流行情况进行了较为详细的调查研究。另外针对致病性较强的优势虫种柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella），选择了艾美耳球虫各虫种间保守性较高的3-1E基因进行克隆和原核表达，为探讨该重组蛋白是否可以作为鸡球虫基因工程疫苗免疫预防研究奠定了基础。
　　 1. 对哈尔滨地区218个鸡场进行了调查，粪便检查显示有136个鸡场感染艾美耳球虫，感染率为62.39％。其中呼兰区和香坊区感染率高达80％以上。同时通过显微镜检查，依据鸡球虫各虫种的基本特征，鉴定哈尔滨地区鸡球虫感染的种类共有6种，分别为柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）以及和缓艾美耳球虫（E. mitis）。
　　 2. 因鸡球虫在自然感染的情况下，多为混合感染。本研究在调查哈尔滨地区鸡球虫感染时，发现各调查点均为5种或5种以上的球虫感染，且均有柔嫩艾美耳球虫感染，感染率较高，达39.83％；在100×倍显微镜下观察球虫卵囊数量，随机计数每个粪样的5个视野，其卵囊总数的平均值作为感染强度的判定依据，结果显示哈尔滨地区球虫处于轻度和中等强度感染，应适当地做好防治措施；从感染的不同日龄看，0～30日龄的鸡雏球虫感染率达到了40.00％，而30～60日龄鸡感染率最高，达76.47％。
　　 3. 通过单卵囊分离技术成功的分离了哈尔滨地区6种鸡艾美耳球虫，分别为柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）。
　　 4. 应用巢式PCR技术成功的对分离的哈尔滨地区鸡艾美耳球虫的ITS1区进行了种株鉴定，同时对克隆测序的所有艾美耳球虫种株进行了同源性分析和系统进化分析。
　　 5. 应用RT-PCR技术扩增出柔嫩艾美耳球虫哈尔滨株子孢子3-1E基因片段，结果表明，3-1E基因含有一个开放阅读框（ORF），长513bp。对此基因片段进行克隆，经鉴定正确后，亚克隆到表达载体pET-32a（+）上，在受体菌Rosetta进行了原核表达。经SDS-PAGE电泳分析显示融合蛋白主要存在于上清中，为可溶性表达。Westen-blot分析表明表达的蛋白可被感染柔嫩艾美耳球虫鸡的阳性血清特异性识别。