农用抗生素尼莫克汀高产菌株的推理选育

摘要

尼莫克汀（Nemadectin）是一种十六元大环内酯类抗生素，由蓝灰链霉菌Streptomyces cyaneogriseus sp. Noncyanogenus经发酵过程生产。作为米尔贝霉素族的一员，尼莫克汀主要用于合成活性更强的农药兽药莫西克汀（Moxidectin）。本论文运用推理选育的方法筛选尼莫克汀高产菌株，然后运用正交设计方法对培养基和培养条件进行优化，确定了适合于高产菌株的发酵参数，为产业化生产提供参考。
　　 首先对尼莫克汀产生菌原始菌株进行两次纯化，使遗传性状稳定，以纯化后的菌株N-03-16为出发菌株，经紫外诱变进行推理选育。根据尼莫克汀的生物合成途径和代谢调节机理，选择乙酸钠、缬氨酸、缬氨酸氧肟酸和2-脱氧葡萄糖作为筛选压力，结合分离纯化，得到菌株N-09-20，产量达到77 mg/L，比原始菌株提高了4倍。同时对比了内源性前体诱导和结构类似物耐受的筛选效果。之后经过链霉素抗性筛选得到菌株N-11-37，产量达到99 mg/L，较出发菌株N-09-20提高了28.6％，由此建立了链霉素筛选模型。以N-11-37为出发菌株，经过4次自身代谢产物耐受，筛选得到高产菌株N-16-19，产量达到172 mg/L，比原始菌株提高了10倍，成功的应用了自身代谢调节突变筛选模型。对菌株N-16-19进行了遗传稳定性试验，经过5次传代后，结果表明该菌株有良好的遗传稳定性。
　　 对高产菌株N-16-19的发酵条件进行了优化，确定了一系列发酵工艺。经过配方优化之后，确定了新的斜面培养基和发酵培养基组成。在新的斜面培养基上，孢子形态为青灰色，圆形，菌丝产黄绿色色素。优化后的发酵配方为（g/L）：葡萄糖20、乳糖30、麦芽糊精40、玉米淀粉20、蛋白胨2、黄豆饼粉4、棉籽饼粉8，CaCO3 3，Ph 7.0，使用自来水配制。在新的发酵配方下，尼莫克汀的产量达到236 mg/L，比原始配方提高了67％。同时，确定了菌龄、接孢量、种龄、移种量和发酵温度等发酵过程参数，同时对溶氧要求进行考察，得知该菌株对溶氧水平要求很高。通过短链脂肪酸前体和氨基酸前体的添加，考察了尼莫克汀产生菌对前体的利用情况，并且确定在72 h、120 h、168 h分3次添加总量为0.2％的乙酸钠，以及在48 h、96 h、144 h分3次添加总量为0.3％的缬氨酸时，尼莫克汀的产量有大幅度增加。
　　 研究了在新的发酵工艺下尼莫克汀产生菌发酵过程中的产素变化，以及生物量、Ph、总糖、还原糖和氨基氮的代谢变化。确定了发酵过程中，72 h开始产素，在96 h发酵液由棕黄色渐渐转为墨绿色，发酵192 h，尼莫克汀的产量达到最高，此时菌体形态呈现老化，中空，染色浅。在发酵过程中，当Ph值超过7.5时，菌丝断裂，产素停止；当菌体浓度超过30％时，不利于产素。这些摇瓶发酵过程参数为工业化放大生产提供了参考。