大豆C4H基因克隆及生物信息学分析

摘要

大豆（Glycine max（L.）Merr.）是我国重要的粮食和油料作物，含有丰富的蛋白质和脂肪，综合利用价值高，而因为重迎茬问题引起了严重的连作障碍，导致大豆抗逆性降低，产量大幅度下降。近年来，研究表明次生代谢产物的化感效应也是引起连作障碍的重要原因之一，同时次生代谢已成为植物分子生物学研究的热点之一。苯丙烷代谢途径是植物最重要的次生代谢途径之一。肉桂酸-4-羟基化酶（C4H，EC1.14.13.11），又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，催化肉桂酸羟化作用产生4-香豆酸盐，是苯丙烷途径中继L-苯丙氨酸解氨酶（PAL）之后的第二个关键酶。为了从分子水平上揭示大豆C4H的结构特点，并为提高其表达活性提供理论依据，本研究以大豆绥农14为材料，利用RT-PCR技术进行大豆肉桂酸-4-羟基化酶基因mRNA（C4HmRNA）；利用PCR技术进行大豆肉桂酸-4-羟基化酶基因组基因（C4HDNA）的分离克隆并结合RACE技术进行C4H基因3’末端基因的克隆。在此基础上，利用生物信息学手段对C4HmRNA推导出的蛋白质序列进行主要结构分析和功能预测。通过上述研究得到以下结果：
　　 利用RT-PCR方法成功地从大豆叶片中克隆了肉桂酸-4-羟基化酶基因mRNA（C4HmRNA）（登录号为FJ770468）。获得的C4H mRNA基因长度为1766bp，编码区1521bp，与已公布的C4H mRNA序列（登录号为X92437）的编码区相似性达98.77％，两者只有1个碱基的差异（位于1237位的碱基），并与其它植物的该基因序列具有同源性，应用NCBI上的BlastX工具将C4H cDNA的测序结果推导出的蛋白质序列与已知的C4H蛋白质序列（登录号为Q42797）比较，相似性达99.80％，两者只有1个氨基酸的差异（位于396位的氨基酸），编码一个含有506个氨基酸残基的多肽。
　　 运用PCR扩增技术首次克隆了大豆肉桂酸-4-羟基化酶基因组基因C4HDNA（登录号为HM036117）。测序结果表明，C4H DNA含有1个外显子，无内含子，外显子序列与获得的C4H mRNA序列完全一致。
　　 结合RACE技术克隆了大豆C4H基因3’末端序列，并将登录号为FJ770468的大豆C4H基因mRNA升级到FJ770468 updata，长度为1799bp。
　　 用ExPasy软件包和TOPPRED在线分析C4H的理化特性，结果表明C4H的理论等电点PI=5.30，Mw=39092；C4H是易溶、亲水性较强的蛋白，同时有两个明显的疏水峰，有2个跨膜肽段；并运用DNAMAN6.0软件构建了C4H的系统进化树。通过HNN分析二级结构预测结果显示，C4H的α螺旋（Alpha helix）（Hh）：251，49.60％，β折叠（Extended strand）（Ee）：52，10.28％，无规卷曲（Random coil）（Cc）：203，40.12％；Geno3d模建预测，C4H蛋白中β折叠区有57个折叠，折叠区间有24为个α螺旋，此外还有14个卷曲结构。氨基酸序列和结构分析显示C4H蛋白包含了一个保守区，即P450 domain。利用SignalP分析得到信号肽存在几率、信号肽锚定几率均为0.498，切割位点位于28和29位氨基酸之间。

目录

文摘

英文文摘

英文目录

1 引言

1.1 研究的目的和意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 植物次生代谢

1.2.2 植物次生代谢产物的主要合成途径

1.2.3 肉桂酸-4-羟化酶研究概述

1.3 本研究课题的来源及主要研究内容

1.3.1 本研究课题的来源

1.3.2 本研究的主要内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 供试品种

2.1.2 试验所涉及的菌株和质粒

2.1.3 试验所涉及的酶,试剂盒及生化试剂

2.1.4 主要仪器设备

2.2 试验设计

2.2.1 引物设计

2.2.2 试验研究方法

2.3 主要试验方法

2.3.1 C4H cDNA的克隆

2.3.2 C4H基因组DNA的克隆

2.3.3 C4H cDNA 3'端的克隆

2.3.4 生物信息学分析

3 结果与分析

3.1 大豆C4H cDNA基因的克隆

3.1.1 大豆总RNA的提取及检测

3.1.2 大豆C4H cDNA基因的获得

3.2 大豆C4H基因组DNA（gDNA）的克隆

3.2.1 大豆gDNA的提取及检测

3.2.2 大豆C4H gDNA基因的获得

3.3 C4H基因cDNA 3'端的克隆

3.3.1 大豆总RNA的提取及检测

3.3.2 大豆C4H cDNA 3'端基因的获得

3.3.3 大豆C4H cDNA基因与3'末端基因的拼接

3.4 大豆C4H cDNA基因的生物信息学分析

3.4.1 大豆C4H编码蛋白一级结构序列分析

3.4.2 蛋白质的同源性检索及系统发生进化树分析

3.4.3 C4H蛋白质的二级结构预测

3.4.5 C4H蛋白质的立体结构预测

3.4.6 C4H蛋白质的功能结构域分析

4 讨论

4.1 大豆叶片RNA的提取

4.2 大豆C4H基因及克隆方法

4_3 大豆C4H的生物信息学分析

5 结论

致 谢

参考文献

附 录

攻读硕士学位期间发表的学术论文