猪体细胞核移植重构胚构建的影响因素研究

摘要

基因组定点修饰的转基因克隆猪有益于农业生产和人类疾病治疗。尽管，人们通过体细胞核移植技术已经得到了克隆猪和转基因克隆猪，并从中摸索出了一些提高体细胞克隆效率的新方法；然而，由于胚胎体外发育环境的缺陷，体细胞克隆的总体效率仍然较低。本研究旨在建立一套高效的体细胞克隆猪的生产体系。研究了激素、猪卵泡液及表皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响。系统地探讨了供核细胞、非洲绿猴肾细胞共培养体系及培养基中能量底物变化对猪核移植胚发育的影响。同时，本研究探讨了曲古抑菌素A（组蛋白去乙酰化抑制剂）对转基因细胞中EGFP的表达及转基因核移植胚发育的影响，为转基因猪的生产奠定基础。
　　 激素、猪卵泡液、表皮生长因子对猪卵母细胞成熟有促进作用。卵母细胞体外成熟培养过程中，添加10 IU/ml PMSG，10 IU/mlhCG至培养液中，培养22h后撤除激素，卵母细胞的成熟率显著高于其他处理（P<0.05）。当培养液中添加10％的猪卵泡液时，卵母细胞的成熟率显著高于其他处理（P<0.05）。当培养液中添加表皮生长因子时，10ng/ml处理组的卵母细胞成熟率显著高于0 ng，ml和5ng/ml处理组；然而，10ng/ml处理组和15ng/ml处理组的卵母细胞成熟率无显著差异（P>0.05）。
　　 由于大白猪胎儿成纤维细胞易分离、生长快、传代能力强，所以选用该细胞作为核供体细胞。对不同传代次数的细胞进行染色体分析。结果表明，传代7次细胞的正常核型比例在80％左右，满足核移植的要求。随着供核细胞传代次数的增加，重构胚的囊胚率下降。用表面光滑细胞及表面粗糙细胞分别作为核移植供体，表面光滑的细胞可以提高供核细胞与受体卵母细胞的融合率。
　　 Yasumura等人从成年非洲绿猴的肾脏分离得到Vero细胞系。尽管大量的文献都表明Vero细胞对哺乳动物的胚胎发育有促进作用，然而，Vero细胞对猪胚胎发育的影响尚未见报道。本文首次使用Vero细胞作为滋养细胞，旨在探讨共培养体系中Vero细胞对猪孤雌胚及核移植胚发育的影响。结果显示，Vero细胞共培养组的孤雌胚囊胚率及核移植胚囊胚率显著高于对照组（P<0.05），即Vero细胞共培养体系对猪孤雌胚及核移植胚的发育都具有促进作用。
　　 将NCSU-23培养基中的5.56 mmol/L葡萄糖替换为0.2 mmol/L丙酮酸、5.7 mmol/L乳酸，并将此培养基命名为mNCSU-23。根据实验设计，孤雌胚及核移植胚转移到mNCSU-23或NCSU-23中培养。激活第2天统计孤雌胚及核移植胚中的5～8细胞胚胎数。激活第6天统计孤雌胚及核移植胚囊胚形成率及囊胚细胞数。实验结果表明，mNCSU/NCSU处理组的囊胚率显著高丁二对照组（P<0.05）；单纯使用mNCSU-23培养猪胚胎时，囊胚率最低，发育结果最差（P<0.05）。结果证实，在体外培养前两天，用乳酸和丙酮酸代替培养基中的葡萄糖对猪胚胎发育有利。
　　 目前，外源基因导入真核细胞的方法主要包括：病毒感染法、原核注射法、DEAE-葡聚糖转染法、电穿孔法、脂质体转染法等。脂质体法操作简单，不需要昂贵的仪器设备，可大批量转染，且对细胞毒性作用小。故本实验采用脂质体法将pEGFP-C1载体导入大白猪胎儿成纤维细胞中，并对转染参数进行了优化：脂质体4μl，质粒DNA2μg，稳定转染6小时效率较高。将pEGFP-C1质粒载体转染入大白猪胎儿成纤维细胞。经G418筛选后，得到稳定转染的阳性细胞。随传代次数增加，EGFP阳性细胞的比例下降。用曲古抑菌素A预处理转基因供核细胞，同时设立对照组（供核细胞不使用曲古抑菌素A预处理）。蓝光照射转基因供核细胞和转基因的重构胚，观察供核细胞和转基因重构胚中EGFP的表达情况。结果表明，当用50nM曲古抑菌素A处理供核细胞时，供核细胞的EGFP阳性率显著高于对照组；当用50nM曲古抑菌素A处理供核细胞时，重构胚中EGFP的阳性胚率显著高于对照组（重构胚融合激活48h后），且这种EGFP表达的增加至少维持到桑椹胚阶段。此外，TSA处理对转基因细胞有毒性影响，且这种毒性影响是剂量依赖的；当曲古抑菌素A浓度高于50nM时，大部分细胞死亡。用50nM曲古抑菌素A处理供核细胞后，细胞形态发生变化，即细胞拉长、细胞轮廓不清晰。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 猪卵母细胞体外成熟培养研究进展

1.1.1 卵母细胞成熟过程中的特征性变化

1.1.2 卵母细胞成熟过程中的分子调节机制

1.1.3 卵巢来源,猪的品种、年龄及健康状况对卵母细胞体外成熟的影响

1.1.4 血清对卵母细胞体外成熟的影响

1.1.5 激素对卵母细胞体外成熟的影响

1.1.6 卵泡液对卵母细胞体外成熟的影响

1.1.7 颗粒/卵丘细胞对卵母细胞体外成熟的影响

1.1.8 生长因子对卵母细胞成熟的影响

1.1.9 影响卵母细胞成熟的其他因素

1.2 哺乳动物核移植的研究进展

1.2.1 核移植的原理

1.2.2 核移植的步骤和方法

1.2.3 影响核移植重构胚发育的几个因素

1.3 转基因动物研究进展

1.3.1 转基因技术存在的问题

1.3.2 核移植法转基因

1.3.3 转基因技术的应用

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 激素、卵泡液及表皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟影响的实验材料与方法

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.2 核供体细胞对核移植胚胎发育影响的实验材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.3 Vero细胞共培养体系对猪胚胎早期发育影响的实验材料与方法

2.3.1 实验材料

2.3.2 实验方法

2.4 培养基中能量底物对猪胚胎发育的影响的材料与方法

2.4.1 实验材料

2.4.2 实验方法

2.5 曲古抑菌素A对转GFP供核细胞及猪克隆胚发育的影响的实验材料与方法

2.5.1 实验材料

2.5.2 实验方法

3 结果与分析

3.1 激素、卵泡液及表皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟影响的实验结果与分析

3.1.1 实验数据分析

3.1.2 实验结果

3.2 核供体细胞对核移植胚胎发育的影响的实验结果与分析

3.2.1 数据统计分析

3.2.2 实验结果

3.3 Vero细胞共培养体系对猪胚胎早期发育的影响的实验结果与分析

3.3.1 实验数据分析

3.3.2 实验结果

3.4 培养基中能量底物对猪胚胎发育影响的实验结果与分析

3.4.1 实验数据分析

3.4.2 实验结果

3.5 曲古抑菌素A对转GFP供核细胞及猪克隆胚发育的影响的实验结果与分析

3.5.1 实验数据分析

3.5.2 实验结果

4 讨论

4.1 激素、卵泡液及表皮生长因子对猪卵母细胞体外成熟的影响

4.1.1 激素处理时间对猪卵母细胞体外成熟的影响

4.1.2 不同浓度的卵泡液对猪卵母细胞体外成熟的影响

4.1.3 不同浓度的EGF对猪卵母细胞体外成熟的影响

4.2 核供体细胞对核移植胚胎发育的影响

4.2.1 成纤维细胞的分离

4.2.2 传代次数对染色体倍性的影响

4.2.3 供核细胞形态对核移植效率的影响

4.2.4 供核细胞传代次数对核移植效率的影响

4.3 Vero细胞共培养体系对猪胚胎早期发育的影响

4.4 培养基中能量底物对猪胚胎发育的影响

4.5 曲古抑菌素A对转GFP供核细胞及猪克隆胚发育的影响

4.5.1 影响转染效率的因素

4.5.2 成纤维细胞对G418毒性敏感性

4.5.3 TSA对转EGFP细胞及胚胎中EGFP表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文