小鼠白细胞介素-17的克隆、表达及活性鉴定

摘要

白细胞介素-17是近些年来发现的一种强大的前炎症细胞因子，它与受体结合后可诱导表达多种细胞因子和粘附分子，而这些分子在造血、炎症、免疫的不同阶段具有不同功能。IL-17同时也是炎症反应的微调因子，它的过量和不足均会引起疾病。研究发现它除了参与机体免疫调节外，在很多不同疾病（类风湿性关节炎、肠道炎症、系统性红斑狼疮、移植后免疫排斥反应等）尤其是在类风湿性关节炎中发挥了重要的作用。目前虽然有一些针对类风湿性关节炎（RA）的药物，但并不能达到完全抑制病程发展的效果，因此研制更有效的治疗药物将是医药工作者的迫切任务，鉴于IL-17在炎症疾病中的重要作用，因此对IL-17的研究工作也就更显其深远意义。
　　 本实验是研制治疗类风湿性关节炎新型抗体药物的一部分，目的在于表达出具有生物学活性的mIL-17蛋白，为动物药理学实验做好准备工作。
　　 本研究我们利用逆转录PCR技术从经吗IL-1β免疫的小鼠胸腺cDNA中克隆得到了mIL-17成熟蛋白基因，测序分析结果表明其开放阅读框为402bp，编码134个氨基酸。与GenBank上已公布的序列比较，核苷酸序列同源性为100％；将mIL-17克隆至原核表达载体pHisSUMOExpress中并在Rosetta宿主菌进行表达，应用AKTA蛋白纯化系统对经8mol/L尿素变性的包涵体进行了复性，得到了纯度约为95％的mIL-17成熟蛋白。其分子量约为15.5kD，与文献中报道的数据一致。本实验利用Realtime-PCR的方法检测经重组mIL-17刺激的前体脂肪细胞3T3-L1（鼠源成纤维细胞）的IL-6的转录水平，以确定所表达的重组蛋白是否具有生物活性。Realtime-PCR的检测结果显示，重组mIL-17蛋白可以明显上调前体脂肪细胞3T3-L1中IL-6基因的转录水平，且呈剂量依赖性。此外，本实验还通过腹腔注射法向Ⅱ型胶原诱导的RA模型大鼠体内注入重组mIL-17蛋白以检测其是否具有生物学活性。结果显示注射了重组mIL-17蛋白的模型组较之对照模型组关节肿胀严重，且出现了继发病变；同时，病理切片上亦显示注射了重组mIL-17蛋白的模型组较之对照模型组关节囊增厚严重、关节腔内出现了炎性细胞的浸润、软骨破坏严重、软骨骨化现象明显。这些均证明了重组mIL-17蛋白可促进Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎的发生，并加重滑膜炎症和关节破坏。
　　 在实验过程中，我们利用Realtime-PCR证明了重组mIL-17蛋白具有生物活性，为该蛋白生物学活性的鉴定提供了一个简便、有效的方法，且实验中采用经60℃水浴3小时灭活后的重组mIL-17A蛋白作为阴性对照较使用内毒素作为阴性对照更为严谨。此外，本实验采用腹腔注射法在动物模型上研究mIL-17对RA的影响，与已报道的关节内注射法相比，免去了对关节的不必要的损伤，减少了外伤、感染等因素的刺激。因此此实验设计更为严谨，结果也更为可信。
　　 本实验经克隆、表达及纯化后得到了具有生物学活性的重组mIL-17蛋白；应用更加严谨的腹腔注射法证实了IL-17可加剧类风湿性关节炎的病理变化，是该病发生和发展的重要因素，为治疗类风湿性关节炎新型抗体药物的研制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 引言

1.1 RA的病因及治疗药物的研究进展

1.1.1 RA的病因

1.1.2 RA的治疗药物

1.2 白细胞介素-17的结构特征及其生物学活性

1.2.1 白细胞介素-17的结构

1.2.2 白细胞介素-1 7的受体

1.2.3 白细胞介素-17的生物学活性

1.3 白细胞介素-17与疾病的关系

1.3.1 白细胞介素-17与类风湿性关节炎的关系

1.3.2 白细胞介素-17与呼吸系统疾病的关系

1.3.3 白细胞介素-17与神经系统的关系

1.3.4 白细胞介素-17与器官移植后排斥反应的关系

1.3.5 白细胞介素-17与其他疾病的关系

1.4 白细胞介素-17家族其他成员

1.4.1 白细胞介素-17B

1.4.2 白细胞介素-17C

1.4.3 白细胞介素-17D

1.4.4 白细胞介素-17E

1.4.5 白细胞介素-17F

1.5 小鼠白细胞介素-17的结构及表达

1.6 本研究的目的与意义

2 材料

2.1 实验材料

2.2 克隆和表达载体

2.3 酶和生化试剂

2.4 主要仪器和设备

3 方法

3.1 小鼠白细胞介素-17基因的克隆及序列分析

3.1.1 经LPS刺激的小鼠胸腺及脾脏细胞RNA的提取

3.1.2 PCR模板的制备

3.1.3 小鼠成熟白细胞介素-17基因的PCR扩增

3.1.4 PCR产物的纯化

3.1.5 PCR纯化产物与克隆载体的连接

3.1.6 大肠杆菌感受态细胞的制备

3.1.7 重组克隆载体的转化与质粒的提取

3.1.8 阳性重组质粒的鉴定与测序

3.2 重组原核表达质粒pHisSUMO Express-SUMO-mIL-17的构建

3.2.1 目的基因片段的制备

3.2.2 原核表达载体pHisSUMO Express的制备

3.2.3 原核表达载体pHisSUMO Express与目的基因片段的连接

3.2.4 重组愿核表达载体的转化与质粒提取

3.2.5 重组原核表达载体的酶切鉴定

3.3 SUMO-mIL-17融合蛋白在大肠杆菌中的表达

3.3.1 阳性重组质粒转化表达宿主菌

3.3.2 重组工程菌的鉴定

3.3.3 SUMO-mIL-17融合蛋白在大肠杆菌中的表达

3.4 目的蛋白的纯化

3.4.1 Ni-NTA纯化柱的平衡

3.4.2 融合蛋白SUMO-mIL-17的纯化

3.4.3 成熟mIL-17的纯化

3.4.4 Ni-NTA树脂的再生与保存

3.5 重组原核表达质粒的pHisSUMO Express-mIL-17构建

3.5.1 目的基因片段的制备

3.5.2 原核表达载体pHisSUMO Express的制备

3.5.3 原核表达载体pHisSUMO Express与目的基因片段的连接

3.5.4 重组原核表达载体的转化与质粒提取

3.5.5 重组原核表达载体的酶切鉴定及测序

3.6 小鼠白细胞介素-17成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

3.6.1 阳性重组质粒转化表达宿主菌

3.6.2 重组工程菌的鉴定

3.6.3 小鼠白细胞介素-17成熟蛋白在大肠杆菌中的表达

3.7 目的蛋白的纯化

3.7.1 HiLoad 16/60 Superdex 75 Pg（GE）柱的平衡及保存

3.7.2 成熟mIL-17的纯化

3.8 Western blot检测mIL-17的特异性

3.9 在细胞水平上检测重组成熟mIL-17蛋白的生物活性

3.9.1 Realtime-PCR检测引物的设计

3.9.2 3T3-L1前体脂肪细胞的培养与刺激

3.9.3 Realtime-PCR鉴定蛋白活性

3.10 在动物水平上检测重组成熟mIL-17蛋白的生物活性

3.10.1 鸡Ⅱ型胶原与完全弗氏佐剂混和乳化剂（CIA）的制备

3.10.2 大鼠Ⅱ型胶原诱导的关节炎模型的建立

3.10.3 mIL-17的注射

3.10.4 踝关节组织的采集

4 实验结果

4.1 小鼠白细胞介素-17（mIL-17）成熟多肽基因的克隆

4.1.1 小鼠白细胞介素17成熟多肽基因的RT-PCR扩增

4.1.2 重组克隆质粒pMD18-T-mIL-17的鉴定

4.1.3 小鼠白细胞介素17 cDNA序列测定与结果分析

4.2 重组原核表达载体的构建

4.2.1 pHisSUMO Express表达载体和mIL-17基因插入片段的制备

4.2.2 阳性重组质粒的筛选与鉴定

4.2.3 阳性重组工程菌的筛选与鉴定

4.3 小鼠白细胞介素-17蛋白在大肠杆菌中的表达

4.3.1 SDS-PAGE确定SUMO-mIL-17的表达形式及最佳诱导条件

4.3.2 SDS-PAGE确定mIL-17的表达形式及最佳诱导时间

4.4 目的蛋白的纯化

4.4.1 SUMO-mIL-17融合蛋白的纯化、酶切及分离

4.4.2 mIL-17成熟蛋白的纯化

4.5 Western blot检测

4.6 细胞水平上检测重组成熟mIL-17蛋白的生物活性

4.7 动物水平上检测重组成熟mIL-17蛋白的生物活性

4.7.1 实验动物的临床症状

4.7.2 组织病理学变化

5 讨论

5.1 PCR模板的制备

5.2 表达载体的选择和构建

5.3 目的蛋白的纯化

5.3.1 融合蛋白的纯化

5.3.2 包涵体的纯化

5.4 目的蛋白的活性检测

5.4.1 在细胞水平上检测重组成熟mIL-17蛋白生物活性

5.4.2 在动物水平上检测重组成熟mIL-17蛋白生物活性

6 结论

致谢

参考文献

附录A

附录B

附录C

附录D

攻读硕士学位期间发表的学术论文