ICE1基因植物表达载体构建及转化番茄的研究

摘要

番茄（LycoperciconesculentumMill）为茄科番茄属的一年生草本植物，因其果实营养丰富、美味可口，已成一种世界性蔬菜。低温一直是限制番茄生长与分布，影响果实品质和产量的重要环境因子。如何提高番茄对低温的耐受性一直是人们关注的焦点。快速发展的植物基因工程技术为改善番茄品种的抗寒性提供了新途径；其中，导入外源基因提高植物抗逆性已成为现代植物育种的主要手段。而植物表达载体的构建是实现外源基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用的关键。
　　 因此本试验采用PCAMBIA3301植物表达载体和ICE1基因（cds编码区）为基础，构建植物表达载体。利用农杆菌介导法转化番茄，为深入研究ICE1基因在低温抗性途径中的功能奠定基础，并对深入植物抗寒机理的研究，有一定的作用。主要研究结果如下：
　　 （1）将保存在PMD18-T载体上的ICE1基因cDNA片段用NCOI和BSTEII进行双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒回收约1500bp的片段，即目的基因ICE1经NCOI、BSTEII酶切得到目的基因ICE1片段和质粒P3301，用T4DNA连接酶连接后，用热激法转化大肠杆菌DH5a，转化得到的阳性菌落经PCR扩增和酶切鉴定，都得到大小约为1500bp的片段，与目的片段大小吻合，说明番茄ICE1基因片段已连接到植物表达载体P3301上，构建了表达载体P3301-ICE1。
　　 （2）以番茄子叶为外植体，用6-BA与IAA配成9个激素组合，最终确立一个较为理想的分化培养基配方：MS+2mg/L6-BA+0.2mg/LIAA+3％蔗糖+0.8％琼脂，PH5.8。
　　 （3）探索了影响P3301-ICE1表达载体转化番茄的若干因素，建立了一个较为理想的番茄转化体系：子叶在分化培养基上预培养48h；侵染时间为10min；共培养时间为36h；卡那霉素Kan对子叶的筛选压为20mg/L；当芽长到1cm以上时，将抗性芽切下，转入MS+0.5mg/LIAA+20mg/LKan+300mg/LCarb的生根培养基中诱导生根。
　　 （4）对得到的5株抗性植株进行PCR和RT-PCR反应。检测结果表明：有3株扩增出明显的目的条带，阳性株率为60％，初步说明外源ICE1已导入到番茄中。
　　 （5）转ICE1基因的番茄植株经4℃低温胁迫72h后，与对照植株相比，MDA含量明显降低，Pro含量、POD和CAT活性明显升高。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 前言

1.1 本研究的目的与意义

1.2 文献综述

1.2.1 ICE1基因研究进展

1.2.2 农杆菌介导的番茄遗传转化研究进展

1.2.3 转基因番茄研究进展

1.3 本研究的主要内容

2 材料与方法

2.1 拟南芥ICE1基因表达载体的构建及转化农杆菌

2.1.1 材料

2.1.2 试验方法

2.2 番茄再生体系的优化

2.2.1 材料

2.2.2 试验方法

2.3 利用P3301-ICE1表达载体转化番茄

2.3.1 材料

2.3.2 试验方法

2.4 转基因番茄检测

2.4.1 材料

2.4.2 方法

3 结果与分析

3.1 拟南芥ICE1基因表达载体的构建及转化农杆菌

3.1.1 目的基因ICE1的扩增

3.1.2 目的片段与P3301的双酶切

3.1.3 中间表达载体P3301-ICE1的获得

3.1.4 中间表达载体导入农杆菌

3.2 番茄再生体系的优化

3.2.1 6-BA和IAA配比对番茄子叶愈伤组织和不定芽分化的影响

3.2.2 不同浓度IAA对番茄再生苗不定根诱导的影响

3.2.3 再生苗的获得

3.3 利用P3301-ICE1表达载体转化番茄

3.3.1 卡那霉素筛选浓度的确定

3.3.2 预培养和共培养时间对番茄转化的影响

3.3.3 农杆菌浓度对番茄转化的影响

3.3.4 侵染时间对番茄转化的影响

3.3.5 抑菌素Carb浓度的确定

3.3.6 抗性转化植株的获得

3.4 转基因植株的检测

3.4.1 转化植株的PCR检测

3.4.2 转化植株的RT-PCR检测

3.4.3 转基因植株的耐低温检测

4 讨论

4.1 拟南芥ICE1基因表达载体的构建

4.2 番茄再生体系的影响因素

4.3 利用P3301-ICE1表达载体转化番茄的影响因素

4.4 转基因植株的检测

5 结论

致 谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文