腺胃型IBV的分离鉴定及三种不同致病型IBV毒株组织嗜性的比较

摘要

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）被公认为是冠状病毒的代表性病毒之一，主要引起鸡的一种称为传染性支气管炎的急性高度接触性传染病。IBV血清型众多，且不断变异，不同型的病毒株间不能或不能完全交叉保护，免疫失败的现象时有发生；与此同时，IBV组织亲嗜性也在不断发生变异，由嗜呼吸器官、泌尿器官向消化道、生殖器官甚至肌肉组织转移，目前已有呼吸型、肾型、肠型、腺胃型以及多型混合的IBV毒株，致病性越来越复杂，尤其是腺胃型IBV在最近几年引起了国际上一些学者的关注。由此可见，开展有关IBV组织亲嗜性变异研究，探索其变异机制，不仅可为鸡传染性支气管炎的有效防治提供重要的理论依据，还可以为相关冠状病毒的多组织嗜性研究提供参考和借鉴。
　　 本研究以腺胃型IBV为核心研究对象，针对其与呼吸型、肾型等不同致病性IBV的S1基因、与细胞表面蛋白鸡氨肽酶N（chAPN）体外结合能力和在感染SPF鸡机体内的动态变化规律等方面的差异进行了比较分析，同时检测了chAPN在不同日龄SPF鸡机体内各组织中表达变化，旨在通过对上述致病型IBV特性研究分析来探讨IBV多组织嗜性的形成的可能机制。
　　 1、腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的初步分离鉴定
　　 成功从黑龙江省某鸡场发生的以腺胃肿大为特征的病死鸡中分离到1株具有冠状病毒特性的A2-2病毒分离株。通过鸡胚传代、血凝性测定、电镜观察、RT-PCR检测和动物回归实验，初步确定所分离病毒为一株腺胃型鸡传染性支气管炎病毒。
　　 2、IBV A2-2分离株S1基因的序列分析
　　 从IBV结构基因S1基因的角度研究病毒的组织嗜性。对IBV A2-2分离株与相关参考毒株的S1基因的遗传进化关系分析表明：A2-2与QXIBV、D971、GE三株典型的腺胃型IBV亲缘关系较近，同时它们也和近年来分离到的LX4、CK-CH-LSD-07V等基因型毒株亲缘关系较近，分为第一组，表现为与时间及地域流行性的关联更大；而ZJ971、1-98和3-97等腺胃型毒株与H120、H52、W93疫苗株亲缘关系很近，分为第二组，提示疫苗株IBV的变异可能是腺胃型IBV的一个重要来源；Q1、J2等腺胃型毒株则与大多数毒株亲缘关系较远，分为第三组。这提示腺胃型IBV可能有着不同的来源，同一基因型的IBV也可以表现出不同的致病型。
　　 3、源自不同致病型的三株IBV与chAPN体外结合能力的差异比较
　　 经原核表达获得融合蛋白His-chAPN，用ELISA方法比较源自不同致病型的三株IBV与鸡氨肽酶N体外结合能力的差异，以期从病毒结合细胞表面蛋白的角度研究IBV的组织嗜性。实验结果表明：三株不同的致病型IBV与chAPN的结合力表现为A2-2>S-03>M41，这说明不同致病型的IBV毒株与chAPN的结合力的确存在差异，且该差异可能与IBV的组织嗜性变化有关。
　　 4、源自不同致病型的三株IBV及chAPN在感染SPF鸡体内的动态分布
　　 应用荧光定量PCR方法和间接免疫荧光技术分别从核酸及蛋白质水平对IBV呼吸型毒株M41、肾型分离株S-03和腺胃型分离株A2-2在感染SPF鸡体内动态分布进行监测，研究结果表明：三株IBV在感染机体后最先定殖的部位均为气管，其中呼吸型毒株M41对气管的依赖性显得相对较高。三株IBV在肺脏中的增殖程度差异大于气管，A2-2和S-03分离株对于肺的亲嗜性低于M41株。S-03株在肾脏的增殖能力最强，丰度和持续时间很高；A2-2株在肾脏的增殖能力高于M41，这不仅与剖检后所观察到的肾脏病变程度相吻合，也与以往的研究结果相符：腺胃型IB常常伴随一定程度的肾脏损伤。A2-2分离株是嗜腺胃的绝对优势毒株，S-03感染组鸡只的腺胃中几乎检测不到病毒RNA，M41组也仅有少量病毒，可以看出A2-2在腺胃上增殖能力的优势远高于M41株在呼吸道和S-03在肾脏的增殖能力。此外，三株IBV在肝脏、回肠、法氏囊以及血液中增殖情况差异不大，病毒对肝脏和法氏囊大多呈一过性感染，血液和回肠中的病毒量则更低一些。与人工感染实验的结果对比可以发现感染鸡的临床表现与病毒滴度变化存在时间相关性。
　　 本研究中同样使用Real time PCR方法和间接免疫荧光技术来检测病毒感染鸡体后不同组织中chAPN的mRNA水平和蛋白表达水平。结果表明chAPN分布广泛，这与IBV多样的组织嗜性相对应，而其靶器官又表现为比较高和稳定的蛋白表达量。攻毒后不同组织中chAPN的含量变化呈现出比较相似的规律：气管当中chAPN含量较高，且随着日龄的增加而递减；腺胃当中chAPN含量稍低，变化趋势与气管一样；肾脏中chAPN含量虽然不高，但一直保持稳定。这都提示chAPN作为IBV的特异性受体跟病毒的组织嗜性有很大的关联。
　　 从以上两部分的分析结果可以看出，IBV和chAPN在鸡体内的分布存在相关性：气管、肾脏、腺胃中chAPN的含量相对较高且稳定，IBV也相应地对这三个组织有很强的亲嗜性。但chAPN的分布比IBV的组织嗜性范围更广，比如肠道中的chAPN含量稳定，且高于肾脏，但IBV对其嗜性却较弱。针对三株不同致病型IBV来说，感染后chAPN的分布与不同致病型IBV的分布不存在显著的相关性。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1 引言

1.1 鸡传染性支气管炎概述

1.1.1 鸡传染性支气管炎病原学

1.1.2 鸡传染性支气管炎流行病学

1.1.3 鸡传染性支气管炎的诊断

1.2 鸡传染性支气管炎病毒组织嗜性的研究进展

1.2.1 IBV致病型

1.2.2 免疫压力对IBV组织嗜性变异的影响

1.2.3 基因重组对IBV组织嗜株变异的影响

1.2.4 IBV结构蛋白与IBV多组织嗜性的关系

1.3 鸡传染性支气管炎病毒细胞受体研究进展

1.3.1 冠状病毒感染细胞的受体结合机制

1.3.2 氨肽酶N

1.3.3 唾液酸

1.3.4 硫酸乙酰肝素

1.4 研究的目的和意义

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 毒株、菌株和实验动物

2.1.2 质粒与载体

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要缓冲液、培养基、相关试剂配制

2.1.5 主要仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的初步分离鉴定

2.2.2 IBVA2-2分离株S1基因的序列分析

2.2.3 源自不同致病型的三株IBV与chAPN体外结合能力的差异比较

2.2.4 源自不同致病型的三株IBV及chAPN在感染SPF鸡体内的动态分布

3 结果

3.1 腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的初步分离鉴定

3.1.1 鸡胚接种与传代

3.1.2 病毒的血凝性

3.1.3 病毒EID50的滴定

3.1.4 电镜观察

3.1.5 RT-PCR检测

3.1.6 动物回归实验

3.2 IBVA2-2分离株S1基因的序列分析

3.2.1 IBV S1基因的克隆

3.2.2 重组质粒的鉴定

3.2.3 IBV S1基因的序列分析

3.3 源自不同致病型的三株IBV与chAPN体外结合能力的差异比较

3.3.1 chAPN的原核表达鉴定

3.3.2 His-chAPN的活性测定

3.3.3 三株IBV及His-chAPN蛋白多克隆抗体效价测定

3.3.4 三株IBV病毒液的定量

3.3.5 应用ELISA方法比较源自不同致病型的三株IBV与chAPN体外结合能力的差异

3.4 源自不同致病型的三株IBV和chAPN在感染SPF鸡体内的动态分布

3.4.1 IBV人工感染实验

3.4.2 应用荧光定量PCR方法检测IBV和chAPN在感染SPF鸡体内的动态分布

3.4.3 应用间接免疫荧光技术检测IBV和chAPN在感染SPF鸡体内的动态分布

4 讨论

4.1 腺胃型鸡传染性支气管炎病毒的初步分离鉴定

4.2 IBV A2-2分离株S1基因的序列分析

4.3 源自不同致病型的三株IBV与chAPN体外结合能力的差异比较

4.4 源自不同致病型的三株IBV和chAPN在感染SPF鸡体内的动态分布

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文