中国旧大陆猴TRIMCyp基因型检测及EGFP标记的HIV-1假病毒构建

摘要

非人灵长类动物模型被认为是研究艾滋病毒(HIV-1)感染和机体反应的理想动物模型,但是这些动物中存在多种遗传因子限制了HIV-1的跨种传播感染,使该模型的应用受到限制。近年来的研究发现非人灵长类动物体内的一个HIV-1关键性限制因子TRIM5α(tripartitemotif5α,三结构域蛋白),能够结合HIV-1衣壳蛋白(CA)而限制其复制,但不限制猴艾滋病毒(SIV)的复制。部分旧大陆猴存在的逆转录病毒限制因子TRIM5α与CypA的融合蛋白TRIMCyp。TRIMCyp融合蛋白与TRIM5α的限制活性不同,猕猴TRIMCyp融合蛋白能够抑制某些逆转录病毒如HIV-2的复制,但不能限制HIV-1的复制。因此TRIMCyp基因型猕猴对HIV-1的易感性可能明显高于TRIM5α个体,这为HIV-1的跨种传播感染感染提供了有利条件。
　　 本研究分易感宿主筛选、和HIV假病毒构建两部分进行。
　　 1.本试验根据根据GenBank(No.NC_007871.1)中登录的TRIM5基因序列设计了一对稳定有效的引物,应用PCR方法检测中国3种旧大陆猴(恒河猴、食蟹猴及藏酋猴)共655只猴TRIM5基因序列CypA转座子插入的TRIMCyp突变基因型个体的存在状况。首次在中国品系的恒河猴中发现了TRIMCyp基因型的存在,并从食蟹猴中筛选出了TRIMCyp/TRIMCyp纯合子个体,并对食蟹猴TRIMCyp基因型的存在频率进行了统计。这为建立HIV-1易感动物模型提供丰富的资源。本试验同时也建立了RT-PCR方法,可以在mRNA水平上进一步检测恒河猴和食蟹猴的TRIMCyp基因序列和TRIMCyp基因转录特性。并构建了各种融合蛋白的真核表达载体,用于研究各种蛋白对逆转录病毒的限制作用。研究中发现三种猴的TRIMCyp剪接体比例大不相同,这就影响其对HIV-2的限制作用的不同。
　　 2.HIV-1通常只能感染能够表达CD4分子及辅助受体CCR5/CXCR4的细胞,具有高度的细胞嗜性。因此本试验构建了感染范围广泛的HIV的水泡性口炎病毒包装的单轮复制的HIV感染性克隆。VSV-G(水泡性口炎病毒囊膜蛋白)能与细胞膜表面的一种磷脂成分相互作用,通过膜的融合调节病毒侵入细胞,能感染多种生物体的不同类型的细胞,具有广泛的宿主细胞谱。将env部分缺失的HIV-1与pVSV-G共周转染293T细胞,能够包装出HIV假病毒。本试验选择EGFP为报告基因,将其代替HIV部分env基因,构建一个带有报告基因的单轮复制感染性克隆。假病毒感染系统中报告基因的表达水平反映了假病毒的感染情况及其生物学活性。这个假病毒系统可以用于逆转录病毒跨种间传播的探讨,同时对筛选新的抗HIV药物以及优化HIV患者的治疗方案等方面具有重要意义。