复方慢呼抗抗鸡毒支原体药效物质基础及质量控制的研究

摘要

鸡毒支原体(Mycoplasma.gallisepticum，MG)是一种可引起鸡慢性呼吸道病(Chronicrespiratory disease，CRD)的病原菌，感染此病原菌可增加雏鸡的弱雏率，降低蛋鸡的产蛋率，减少肉鸡体重并延长其上市期，降低饲料的转化率等，使养鸡业遭受巨大的经济损失。复方中兽药复方慢呼抗由黄芩、金银花、百部、紫菀和甘草五味中药组成，现已被证实对治疗鸡毒支原体病有良好的疗效，并且毒副作用小、不易产生耐药性，具有很好的开发潜力。但由于复方慢呼抗药效物质基础尚不明确，无法进一步开展其作用机制、体内生物转化及代谢过程的研究，不仅导致复方慢呼抗缺乏可靠的药理学、毒理学研究数据，而且难以建立可控可评的质量标准，大大限制了复方慢呼抗在临床中的应用。因此，阐明复方慢呼抗药效物质基础，不仅可揭示其应用的科学内涵，而且在此基础上可建立全面的质量控制体系，从而有利的保证复方慢呼抗质量的均一、稳定，进一步保证了临床疗效的可重现性，亦为复方慢呼抗作用机制的研究及其“二次开发”打下基础。
　　 本文首先构建了复方慢呼抗的体外指纹图谱，从宏观的角度来评价复方慢呼抗整体的质量，并用同样的色谱条件建立了血清指纹图谱，通过体外指纹图谱与血清指纹图谱的比对，确定了复方慢呼抗体内直接作用的物质基础；同时进行了体外抗鸡毒支原体的药效学试验，将指纹图谱特征峰的峰面积和药效学数据进行灰色关联度分析，确定了复方慢呼抗抗鸡毒支原体的关键药效组分；建立了关键药效组分的定量方法，用微观的定量分析弥补指纹图谱质量控制的不足，从而建立了宏观指纹图谱与药效组分定量分析相结合的复方慢呼抗质量控制的新方法。本研究取得如下几方面的成果：
　　 1.复方慢呼抗指纹图谱的构建及模式分类研究
　　 采用HPLC法对不同批次的复方慢呼抗样品进行分析，对色谱条件(如色谱柱、检测波长、流动相系统、沈脱梯度等)进行了优化，完成了系统的方法学考察，构建了复方慢呼抗HPLC指纹图谱。应用“中药色谱指纹图谱相似性评价系统2004A版”对复方慢呼抗HPLC指纹图谱进行了相似度评价，并借助于SPSS11.5软件对量化的指纹特征(色谱峰峰面积)进行了聚类分析及主成分分析，结果证明三种分析方法具有很好的一致性，可有效地对复方慢呼抗指纹图谱进行评价。此外，还应用建立的色谱条件对复方慢呼抗与各组成药的相关性进行了分析，通过与指纹图谱进行比对，确定了指纹图谱共有峰的来源。在实际应用时，只需将待测样品按本研究所述的色谱条件进行分析，将量化指纹特征数据输入计算机进行运算，就能快速得出评价结果，这对于复方慢呼抗质量控制的研究具有重要的理论意义和实用价值。
　　 2.复方慢呼抗血浆指纹图谱的建立及血中移行成分分析
　　 在已建立的复方慢呼抗指纹图谱基础上，通过优化含药血浆的前处理条件，建立了复方慢呼抗血浆指纹图谱。针对不同时间点的移行成分。运用HPLC-DAD方法对复方慢呼抗提取液、给药血浆和空白血浆进行对比分析。结果显示：在给药后15min入血成分较少，仅有11号峰较明显；30min出现入血原形成分最多；60min时，一些入血成分减弱或消失，同时有6个代谢产物产生；在120min第2号峰被检出并且有较高的响应值，其他峰减弱或消失。通过血清药物化学的研究，可以确定指纹图谱中的共有峰绝大部分均可被吸收入血，是复方慢呼抗体内直接作用的物质基础。
　　 3.复方慢呼抗指纹图谱特征与药效关系的研究
　　 由于甘草对复方慢呼抗指纹图谱共有峰无贡献，故舍去甘草，将其他4味药重新组方研究其谱效关系。以原处方量的0.5，1，1.5倍量作为3个考察水平，以方中4味药为考察因素，以L9(34)正交表进行药量的加减试验。将各组样品分别进行指纹图谱分析和体外抗鸡毒支原体的药效学试验，在获得复方慢呼抗指纹图谱与药效学量化数据的基础上，采用灰关联度分析技术，寻找指纹图谱特征峰所代表的化学成分对药效贡献的大小。结果表明复方慢呼抗抗鸡毒支原体的作用是其“化学成分群”共同作用的结果。并且根据关联度的大小，绿原酸、4号峰(未鉴定)、黄芩营、汉黄芩苜对“抗鸡毒支原体”活性的贡献最大。
　　 4.复方慢呼抗指纹图谱中绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷的含量测定
　　 由于复方慢呼抗中的绿原酸、黄芩苷、汉黄芩苷与抗鸡毒支原体活性的关联度较大，他们的含量在一定程度上可反应复方慢呼抗的质量优劣。因此，本试验采用指纹图谱的色谱条什，以三种成分最大吸收波长作为检测波长，对三种活性成分进行了方法学考察并同时测定各成分的含量。结果表明方法学考察中各项试验结果的RSD均小于3％，表明仪器精密度高、方法的重复性好，并具有良好的回收率利稳定性。复方慢呼抗提取物中三种成分的含量为别为(1.53±0.03)％、(10.93±0.27)％、(4.476±0.11)％。建立的三种成分同时测定方法，不仅使定量分析更加简便、快捷，并且可以弥补指纹图谱存定量控制方面的不足，二者结合可以更有效、全面的控制复方慢呼抗的质量。
　　 5.复方慢呼抗提取工艺的研究
　　 黄芩苷、汉黄芩苷、绿原酸已被确定为复方慢呼抗抗鸡毒支原体的关键组分，引入总评“归一值”将三个指标综合为一个指标，在对提取温度、提取时间、液料比进行单因素考察基础上，采用Box-Behnken响应面法进行了工艺的优化。通过Design-expert软件7.0对此模型的最佳结果进行预测，当提取温度为92.58℃，液料比为25.23:1，提取时间为2.42h时，预测最佳OD值为0.741，经试验验证，获得的OD值为0.7591，偏差仅为2.44％。最后进行了提取次数的考察，结果显示第二次提取可明显的改善提取效果，但再增加提取次数对成分的溶出率影响不大，因此选择提取次数为2次。考虑到实际操作的可行性，将最终提取工艺确定为提取温度93℃，液料比25:1，提取时间92.4h，提取次数2次。通过建立以药效组分为指标的提取工艺，可实现在同样药量下，保证有效成分的最大溶出，使得复方慢呼抗的作用得到进一步保障。
　　 本研究为中兽药抗鸡毒支原体药效物质基础及质量控制的研究提供了一条新途径，即首先采用血清药物化学的办法确定中兽约体内直接作用的物质基础，冉用谱效结合的方法辨识出关键药效组分。同时，提出以指纹图谱结合关键药效组分定量分析的方法，来全面的控制复方中兽药的质量。本研究具有理论意义和实用价值，同时对指纹图谱技术、血清药物化学及谱效关系在中兽药中的应用起到了示范作用。