禽流感(avian influenza，AI)是由A型流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的一种传染病，于1878年首次在意大利爆发。本病可引起病禽头部水肿、鸡冠和腿部发绀、呼吸困难、腹泻、产蛋量下降及严重的神经症状。禽流感病毒不仅可以感染家禽，还可以引起哺乳动物和人类发病，引起世界范围内的广泛重视。本研究利用H5N2亚型禽流感全病毒制备血凝素(Hemaggluttinin，HA)单克隆抗体(Monoclonal antibodies，McAb)，利用噬菌体肽库技术对单克隆抗体进行表位筛选，为研究禽流感病毒血凝素抗原结构信息及探索禽流感病毒新型表位检测方法奠定基础。 本研究采用鸡胚接种法扩增H5N2亚型禽流感病毒，病毒接种鸡胚进行繁毒，收集的尿囊液经过超速离心、蔗糖梯度离心、脱糖，最后获得纯化病毒。利用纯化全病毒免疫SPF BALB/c小鼠，将免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，通过间接ELISA方法筛选阳性克隆后，共获得4株单克隆抗体：GE5、DD4、FF4、DE1，经过Western blot和激光共聚焦试验鉴定，结果表明，GE5株单抗能够稳定分泌HA抗体，其杂交瘤细胞上清效价为1:2000，诱导小鼠产生的腹水效价为1:64000。本株单抗重链为IgG1亚型，轻链为κ链。利用Protein G对腹水进行亲和纯化，用于后续抗原表位筛选试验。利用噬菌体PH.D.-12肽库对纯化后腹水进行表位筛选，经过3轮淘选，噬菌体得到特异性富集。以单抗包板，将淘选产物作为一抗，抗M13抗体作为二抗，进行间接ELISA验证试验，共确定48个阳性克隆。扩增刚性克隆，提取噬菌体DNA进行序列测定和序列分析。结果显示，32个噬菌体样品所展示的12肽段具有相同的氨基酸序列，其组成为：N I H H G A L V R H QV。采用DNAStar软件将12肽段与H5N2亚型禽流感病毒HA序列进行比对分析，结果表明，12肽与病毒HA193aa-204aa位点的相似性为33.3％。将筛选得到的12肽序列合成多肽，溶解后包板，以单抗作为一抗，HRP标记的抗鼠IgG作为二抗，进行间接ELISA试验，ELISA结果呈阳性，证明合成多肽能与单抗发生特异性结合。PCR法定点突变病毒HA193aa-204aa位点处与12肽相一致的4个氨基酸(第194、195、196、203位氨基酸)，检验表达突变HA蛋白与单抗的结合情况。首先以全病毒RNA逆转录产物为模板，利用HA引物PCR扩增病毒HA片段。设计突变引物，PCR扩增定点突变HA片段，将突变HA片段连接在PMD18-T Vector载体上，成功构建PMD18-T Vector-HA载体。利用Smar I和Xho1 I内切酶对PMD18-T Vector-HA和pCAGGs载体进行双酶切，通过连接、转化，成功构建瞬时表达质粒pCAGGs-HA。将质粒转染SF9细胞，成功表达后，以单抗作为一抗，以FITC标记的抗鼠IgG作为二抗，进行激光共聚焦试验，结果表明，表达突变HA蛋白的SF9细胞，其荧光信号强度不如表达正常重组HA蛋白的SF9细胞，冈此推测McAb针对的抗原表位可能在病毒HA序列的193aa-204aa位点处。本研究为进一步研究H5N2亚型禽流感病毒HA蛋白的抗原结构信息，构建新型禽流感病毒抗原表位诊断方法奠定了基础。
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