苏云金芽孢杆菌中抗生素Zwittermicin A的分离纯化与检测

摘要

ZwittermicinA是由蜡状芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌产生的一种新型的广谱抗生素，是已知唯一的线性氨基多元醇类抗生素，对卵菌、藻类、原生生物和多种G+和G-细菌及部分植物病原真菌均表现出一定的抑菌活性。此外，该抗生素还能与苏云金芽孢杆菌Bt晶体蛋白协同作用，提高其杀虫活性，减少Bt制剂用量，降低害虫抗药性的产生。ZwittermicinA作为一种新型的农用抗生素，具有很高的研究价值和应用价值，但目前由于缺少标准品，关于ZwittermicinA的很多研究都难以进行。
　　 本研究主要围绕苏云金芽孢杆菌HD-1中ZwittermicinA的分离纯化与检测方法的建立进行初步研究。首先，对苏云金芽孢杆菌HD-1扩大生产的发酵工艺进行了研究，优化了发酵条件和ZwittermicinA粗提液制备流程，为ZwittermicinA的分离纯化奠定了基础。发酵条件为：采用气升式发酵罐培养，选择大豆分离蛋白培养基为发酵培养基，培养温度为30℃，发酵时间为36h，培养基初始pH为7.5。其次，选用非极性大孔树脂LX-68M初步纯化。大孔树脂纯化条件为：选择非极性大孔树脂LX-68M，静态吸附3h，去离子水洗脱6BV，收集后减压浓缩，回收率为87％。再次，用硅胶柱层析进行二次纯化，根据ZwittermicinA与茚三酮的显色反应，以及草生欧文氏杆菌对其敏感等特点，进行活性物质的跟踪监测并收集。硅胶柱层析纯化条件：选择100～140目硅胶，湿法装柱，干法上样，柱床高度为40cm，上样体积为5mL，洗脱剂为乙酸乙酯：甲醇=70:30(V/V)，流速0.5mL/min。最后，对纯化后样品用分析型HPLC-MS进行纯度分析，ESI-MS进行分子量鉴定，最后得到纯度为89％的ZwittermicinA精制品约90mg(1L发酵液)。从而建立了一种效能高，成本低，可重复性强的ZwittermicinA精制品回收工艺，为ZwittermicinA标准品的半制备提供了前提条件。
　　 本研究建立了3种ZwA含量的检测方法。首先是相对含量检测法，ZwA含量与抑菌圈的直径存在良好的线性关系，根据抑菌圈直径大小来计算ZwA相对含量。其次是HPLC检测方法，最佳色谱条件为反相C18分析柱，流动相为水：甲醇=85:15(V/V)，紫外检测器，检测波长210nm，流速为0.5mL/min，进样量10μL，柱温35℃，保留时间为10.0～10.5min，检测出ZwittermicinA精制品的纯度为89％。最后是以腐胺为标准品，建立了茚三酮显色法测ZwittermicinA含量。其中，HPLC检测条件的建立为ZwittermicinA的HPLC半制备奠定了基础，以腐胺为标准品的茚三酮显色法测，也解决了由于没有标准品而无法定量测定ZwittermicinA含量的障碍，为今后关于ZwittermicinA纯化的进一步研究以及其作为增效因子在生物防治中的应用奠定了基础。