GsCBRLK和GsTS2基因改良农菁1号苜蓿耐盐性的研究

摘要

土壤盐渍化和次生盐渍化问题在世界范围内广泛存在，全世界有盐渍土壤约9.5×106km2，我国盐渍土面积约7.5×105km2，严重制约我国乃至世界的农业生产。对于盐碱化地区，多数学者认为改良盐碱地最经济有效的方法是种植耐盐植物。利用基因工程手段进行分子育种，遗传改良具有经济价值植物品种的耐盐性状，培育耐盐转基因植物新材料和新品种，已成为推进盐渍土地改造利用、维持生态平衡的有效方法。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)素有“牧草之王”的美称，是世界上栽培最早、分布最广，也是最优良、最重要的一种优质豆科牧草。在水土保持，防止土壤盐碱化、荒漠化以及改良环境等方面起着重要的作用。尽管苜蓿为中等耐盐植物，但在盐胁迫条件下，苜蓿的出苗、生长及饲草产量也会受到抑制，因此需要培育更耐盐的苜蓿新品种。植物的耐盐性是一个相当复杂的问题，特别是高等植物的耐盐性由多基因控制，是多基因协同作用的结果。通过分子育种导入个别功能基因对植物抗逆性的改良效果十分有限，即使进行多基因的联合导入，各基因间的相互协调问题也很难解决。而一些在信号转导网络中起调控作用的蛋白质因子，特别是激酶蛋白，单基因的表达就可以启动信号传导网络，激活下游众多功能基因的转录、表达和功能蛋白的活化，从而达到综合改良作物抗逆性的效果。野生大豆(Glycine soja Sieb.Et Zucc.)具有丰富的耐逆基因资源，是耐逆基因克隆的理想材料。
　　 本研究选取实验室先前从野生大豆中克隆得到的耐盐蛋白激酶基因GsCBRLK和GsST2，通过农杆菌介导法分别转化农菁1号苜蓿(Medicago sativa L.cv.Nongjing No.1)，获得了转基因植株，并对转基因受体农菁1号苜蓿的苗期耐盐性进行初步研究，确定了农菁1号苜蓿的耐盐程度。以此为参考对转GsCBRLK和GsST2基因农菁1号苜蓿进行了耐盐性分析，最终获得了耐盐性明显提高的转基因苜蓿。主要研究结果如下：⑴获得转GsCBRLK和GsST2基因农菁1号苜蓿。采用农杆菌介导法将GsCBRLK基因转入农菁1号苜蓿，获得抗性植株110株；PCR阳性植株51株，PCR阳性率46％；对部分PCR阳性植株进行RT-PCR检测，证明了GsCBRLK基因能够在转基因植株中转录并且超量表达。采用农杆菌介导法将GsST2基因转入农菁1号苜蓿，获得抗性植株46株；PCR阳性植株18株，PCR阳性率39％；对部分PCR阳性植株进行RT-PCR检测，证明了GsST2基因能够在转基因植株中转录并且超量表达。⑵确定了农菁1号苜蓿耐盐筛选浓度。为了对获得的转基因苜蓿进行耐盐性分析，本研究对转基因受体农菁1号苜蓿的苗期耐盐性进行初步研究，确定了农菁1号苜蓿的耐盐筛选浓度：测定农菁1号苜蓿在不同时间点、不同盐胁迫浓度下的丙二醛(MDA)、叶绿素(Ch1)和脯氨酸(Pro)含量，表明：随着盐浓度的增加，MDA含量逐渐升高，但随胁迫时间的延长，在200、300 mmol/L NaCl处理下，农菁1号苜蓿的MDA含量表现出先增加，后下降，然后又上升的动态变化趋势。随着胁迫浓度的增加和时间的延长，苜蓿受到的盐害逐渐增大，Ch1含量逐渐降低，Pro含量大量累积，但Pro累积程度与其耐盐表现并不完全一致。观察农菁1号苜蓿在不同时间点、不同盐胁迫浓度下的表型情况，表明：低浓度盐胁迫对其生长无显著影响，农菁1号苜蓿具有较强的耐盐性，能够抵抗持续15 d的200mmol/L NaCl的胁迫，但难以耐受300 mmol/L NaCl的胁迫，特别是400 mmol/L NaCl的高盐胁迫。由此对转基因农菁1号苜蓿进行耐盐性分析时，选定300 mmol/L NaCl作为胁迫浓度，400 mmol/L NaCl作为致死浓度。⑶获得耐盐性提高的转GsCBRLK和GsST2基因农菁1号苜蓿。对转GsCBRLK和GsST2基因农菁1号苜蓿进行了耐盐性分析。高浓度盐处理下的表型以及相关生理生化指标(质膜透性、丙二醛含量、叶绿素含量、SOD活性)的分析结果均表明，目的基因在农菁1号苜蓿中的超量表达明显提高了转基因苜蓿的耐盐性：对获得的转GsCBRLK基因苜蓿进行了耐盐性分析。在300 mmol/L NaCl条件下进行胁迫处理，测定处理0、3、6、9、12、15 d时的质膜透性、丙二醛和叶绿素含量，以及胁迫15 d时的SOD的活性；并统计400 mmol/L NaCl处理15d时植株的死亡率。结果显示：300 mmol/L高盐胁迫15 d后转GsCBRLK基因苜蓿仍能正常生长，而野生型苜蓿则遭受盐害严重；转GsCBRLK基因苜蓿的相对电导率极显著低于野生型，MDA含量也显著低于野生型，而Ch1含量和SOD活性都显著高于野生型；在400 mmol/L NaCl处理下，转GsCBRLK基因苜蓿的死亡率(13.33％和10％)明显低于野生型植株(63.33％)。表明GsCBRLK基因的超量表达明显提高了转基因苜蓿的耐盐性。对获得的转GsST2基因苜蓿进行了耐盐性分析。在300 mmol/L NaCl条件下进行胁迫处理，测定处理0、3、6、9、12、15 d时的质膜透性、丙二醛和叶绿素含量，以及胁迫15d时的SOD的活性；并统计400 mmol/L NaCl处理15d时植株的死亡率。结果显示：300mmol/L高盐胁迫15 d后转GsST2基因苜蓿仍能正常生长，而野生型苜蓿则遭受盐害严重；转GsST2基因苜蓿的相对电导率极显著低于野生型，MDA含量也显著低于野生型，而Ch1含量和SOD活性都显著高于野生型；在400 mmol/L NaCl处理下，转GsST2基因苜蓿的死亡率(16.67％和13.33％)明显低于野生型植株(63.33％)。表明GsST2基因的超量表达明显提高了转基因苜蓿的耐盐性。