产甲酸草酸杆菌细胞数群体感应系统hdtS基因的克隆和功能分析

摘要

肾结石病(Kidney stone disease)是泌尿外科常见的疾病之一，草酸钙结石(Calcium oxalatestone，CaOx)是各种类型肾结石里最为常见的一种，占肾结石的80％以上，草酸钙肾结石的发生与草酸在人尿中浓度高低有关。产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter formigenes，OxF）则是一株能够以草酸作为唯一的碳源和能源的专性厌氧的革兰氏阴性菌。目前的研究显示，在预防治疗肾结石病方面行之有效的重要手段之一就是给肾结石患者服用OxF菌剂，并使之在人的肠道内定殖。然而，很多因素影响该菌株在肠道中定殖却制约着该菌株在临床中的应用发展。研究表明，很多肠道细菌的定殖受到细胞数群体感应系统(Quorum sensing，QS)的控制。QS机制是由细菌向外界释放一种或者几种自诱导剂(Autoinducer)并通过对它们的探测进行交流以调控群体行为的机制。
　　 革兰氏阴性菌的细胞数群体感应系统由产生自诱导剂酰基高丝氨酸内酯(AHL)的合成酶和调控蛋白两部分组成。目前所发现的细胞数群体感应系统根据其合成酶和调控蛋白大体可分为三类:LuxI-LuxR系统、LuxM-LuxN/AinS-AinR系统和HdtS。对于前两类系统的研究比较深入详细，然而第三种群体感应系统的HdtS是一类明显区别其它两类的AHL合成酶。与hdtS基因有关的研究仅限于几个报道，而且目前为止没有发现与其相关的调控蛋白。它是在2000年才被在荧光假单胞菌（Psdeuomnoda.fluorences）中发现的。hdtS基因与大肠杆菌（Escherichia coli）的编码溶血磷脂酸脂酰转移酶plsC有20％的同源性，其蛋白HdtS能够产生3-羟基-碳14∶1、碳10∶1或碳6∶1的三种高丝氨酸内酯。在专性嗜酸的氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）中，Act蛋白与HdtS有37％同源性，编码该蛋白的act基因与编码甘氨酸tRNA合成酶的α、β亚单位的glyQ和glyS以及编码磷酸脂酶的gph形成一个基因簇。这一基因位点在整个变性菌门（Proteobacteria）中具有高度的保守性，基因序列也很一致。Act蛋白被证实编码合成链长为14碳的酰基高丝氨酸内酯，它负责调控与氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）中的Lux系统群体感应系统。
　　 产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）的两个菌株OXCC13和HOxBLS的基因组全序列已经被测序完成。在本研究中，我们借助已知的群体感应效应的模型菌株海洋费氏弧菌(Vibriofischeri)的luxI/luxR基因、luxM/luxN基因和ainS/ainR基因以及荧光假单胞菌（P.fluorences）的hdtS基因与产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）的基因组全序列进行比对，结果发现OXCC13和HOxBLS均具有两个推测编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸转移酶(putative1-acyl-sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase)与hdtS基因高度同源性，其中一个基因序列号为OFBG_01243(OXCC13)、OFAG_01224(HOxBLS)。我们拟使用对HOxBLS的基因组DNA为模版，进一步对该基因序列分析，发现该基因不仅与荧光假单胞菌(P.fluorences)的hdtS基因高度同源，而且与目前被鉴定的编码HdtS型AHL合成酶的氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）中的act基因也高度同源。此外，而且产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）中hdtS基因与编码甘氨酸tRNA合成酶的α、β亚单位的glyQ和glyS以及编码磷酸脂酶的gph形成一个基因簇，这与氧化亚铁硫杆菌(A.ferrooxidans)中的act基因与编码甘氨酸tRNA合成酶的α、β亚单位的glyQ和glyS以及编码磷酸脂酶的gph形成的基因簇的基因顺序也高度一致的。因此，我们推测产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）中这一与hdtS/act有高度同源性的基因很可能就是编码HdtS类的群体感应系统的候选基因。然而，在分析过程当中还意外发现另一个基因被推测编码1-酰基-sn-甘油-3-磷酸转移酶(putative1-acyl-sn-glycerol-3-phosphateacyltransferase)，该基因与上述的hdtS基因，与荧光假单胞菌（P.fluorences）的HdtS蛋白，及氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）中的Act蛋白均斗具有一定的同源性。在产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）中，既然AGPA与HdtS均被推测为1-酰基-sn-甘油-3-磷酸转移酶，且二者具有一定同源性，AGPA与其它两个被鉴定的HdtS型AHL合成酶也有一定同源性，所以我们选择AGPA基因作为另一个AHL合成酶的候选基因。
　　 为了获得hdtS与AGPA的片段，我们利用PCR手段以（O.formigenes）HOxBLS基因组DNA为模板，分别体外扩增两个基因片段。并通过T-A克隆的方法将其与pEASY-T3载体连接，得到几个阳性克隆，并通过菌落PCR，双酶切的方法对其进行验证。然后，选择其一进行测序，得到了与理论上基因序列一致的阳性克隆子。为了验证这两段基因是否具有高丝氨酸内酯合成酶的功能，我们将hdtS与AGPA构建到表达载体pET19中，检验结果，其能够得到表达及大量的可溶性蛋白，并且蛋白大小与预测的蛋白大小基本一致。这为接下来验证这两种基因的功能提供了有力的理论依据。最终，我们利用平板菌株报告法对这两段基因是否具有高丝氨酸内脂合成酶进行初步验证，发现hdtS确实具有该合成酶功能，而AGPA却并没有这种功能。在这一初步结果的基础上，为了能更准确并有选择性地检测到高丝氨酸内脂，我们准备利用GC-MS的方法对BL21/pET19-hdtS细菌提取物进行检测，达到对其定性的目的。
　　 至今为止，没有任何产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）的细胞数群体感应系统的有关基因的报道。既然产甲酸草酸杆菌（O.formigenes）是极其重要的治疗和预防肾结石疾病的益生菌，所以对于该基因的克隆及功能分析对于该菌株的群体感应系统的了解就具有极其重要性与迫切性，并且我们对该菌株的群体感应系统的有关研究对探究影响该菌株在人的肠道内定殖的因素以至于该菌株在治疗和预防肾结石疾病的临床上的应用具有深远地重要意义。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 产甲酸草酸杆菌在有关预防治疗肾结石方向的研究进展

1．1．1 草酸钙结石疾病

1．1．2 产甲酸草酸杆菌及其在肠道内草酸代谢中的作用

1．2 O．formigenes运转的影响因素

1．2．1 O．formigenes的潜在应用价值

1．3 细菌细胞数群体感应分子水平调控机制研究进展

1．3．1 群体感应

1．3．2 群体感应分子水平调控机制

1．3．3 群体感应信号分子AHLs检测方法

1．4 本论文的研究内容与技术路线及研究的目的意义

1．4．1 研究意义

1．4．2 研究目的

1．5 研究内容与技术路线

1．5．1 研究内容

1．5．2 技术路线

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．1．4 培养基和培养条件

2．2 实验方法

2．2．1 热启动PCR扩增基因

2．2．2 T-A克隆载体构建

2．2．3 表达载体构建

2．2．4 产甲酸草酸杆菌HOxBLs及OXCC13的群体感应系统基因组学分析

2．2．5 表达载体在大肠杆菌中的表达

2．2．6 平板菌株报告法检测高丝氨酸内酯酶活性

3 结果与分析

3．1 候选基因的确定

3．1．1 候选基因hdtS的确定

3．1．2 候选基因AGPA的确定

3．2 T-A的克隆载体构建

3．2．1 pEASY-T3-hdtS的克隆载体构建及验证

3．2．1 pEASY-T3-AGPA的克隆载体构建及验证

3．3 表达载体的构建及验证

3．3．1 pET19-hdtS表达载体的构建及验证

3．3．2 pET19-AGPA表达载体的构建及验证

3．4 pET19-hdtS及pET19-AGPA表达载体在大肠杆菌中的表达

3．5 hdtS及AGPA高丝氨酸内酯合成酶功能鉴定

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表或待发表的学术论文