水禽细小病毒VP3蛋白表位鉴定及重组腺病毒载体构建

摘要

鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)是动物病毒中最小的一类单链DNA病毒，属细小病毒科细小病毒属，临床上以腹泻、渗出性肠炎等为主要临床症状，表现较高的发病率和死亡率，严重危害水禽养殖业的发展。通过对水禽细小病毒VP3蛋白抗原表位的鉴定及其重组腺病毒载体的构建，为GPV和MDPV新疫苗的研发和治疗提供新的参考。
　　 抗原表位对免疫治疗试剂和疫苗的设计等有重要意义。本研究利用噬菌体展示技术对纯化后的GPV VP3蛋白单克隆抗体4A2进行3轮淘选，在第3轮的淘选中随机挑选8个克隆进行DNA测序，通过对序列的分析，发现获得一致序列DYRFHH。与VP3蛋白氨基酸序列对比后，发现该序列与第65～88位的氨基酸有很高的同源性，确定该表位为65DYRFHH88。为进一步验证该序列是否为一抗原表位，以噬菌体为包被抗原，做ELISA检测，结果表示DYRFHH可以被单抗4A2特异性识别，证实65DYRFHH88为一构象表位。VP3蛋白抗原表位的精确鉴定，可以帮助了解其抗原结构与功能的关系，并为GPV和MDPV亚单位疫苗的设计和检测方法的建立提供依据。
　　 VP3蛋白是水禽细小病毒的结构蛋白，内含GPV主要抗原决定簇成分，是主要免疫保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体。根据GPV和MDPV VP3蛋白的基因序列分别设计合成两对引物，扩增VP3基因，并利用腺病毒重组技术将水禽细小病毒VP3基因克隆到pShuttle-CMV转移载体上，将重组转移载体经Pme I酶切线性化后电转入BJ5183感受态菌种与腺病毒骨架载体pAdEasy-1进行菌内同源重组。重组的质粒经PacⅠ酶切，分别得到30kb大片段和3kb及4.5kb小片段的重组质粒即为阳性质粒。将鉴定为阳性的重组腺病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染到HEK-293细胞中，待10d左右细胞出现病变后，收毒传代，进行PCR和间接免疫荧光鉴定，鉴定结果表明，实验成功构建了表达VP3基因的重组腺病毒rAd-GPV-VP3和rAd-MDPV-VP3，为水禽细小病毒新型疫苗的研究提供了一个新的思路。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 水禽细小病毒概述

1．2 水禽细小病毒的特性

1．2．1 水禽细小病毒的理化性质

1．2．2 水禽细小病毒结构蛋白及其功能

1．2．3 水禽细小病的流行病学及临床症状

1．2．4 水禽细小病VP3基因疫苗的研究进展

1．2．5 GPV抗原表位的研究进展

1．3 抗原表位的研究进展

1．4 应用噬菌体展示技术鉴定抗原表位

1．5 腺病毒载体研究进展

1．5．1 腺病毒载体的结构和功能

1．5．2 腺病毒载体的优势和缺陷

1．5．3 腺病毒载体的发展

1．5．4 腺病毒载体在疫苗研究中的应用

1．6 研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 载体、菌种及细胞

2．1．2 病毒

2．1．3 工具酶

2．1．4 主要试剂

2．1．5 抗体和主要耗材

2．1．6 引物设计软件

2．1．7 序列分析软件

2．1．8 主要仪器

2．2 GPV结构蛋白VP3抗原表位的筛选鉴定

2．2．1 单抗的纯化

2．2．2 噬菌体表面展示肽库的生物淘选

2．2．3 噬菌斑的扩增和快速纯化

2．2．4 噬菌体DNA的序列测定

2．2．5 噬菌体ELISA检测

2．3 水禽细小病毒VP3蛋白重组腺病毒载体的构建

2．3．1 病毒DNA的提取

2．3．2 VP3基因扩增引物的设计

2．3．3 VP3基因的PCR扩增

2．3．4 PCR产物的胶回收纯化

2．3．5 pMD18-T载体克隆质粒的构建及鉴定

2．3．6 重组腺病毒穿梭转移载体的构建及鉴定

2．3．7 重组腺病毒质粒的构建及鉴定

2．3．8 转染HEK-293细胞包装重组腺病毒

2．3．9 重组腺病毒的鉴定

3 结果

3．1 GPV结构蛋白VP3抗原表位的筛选鉴定

3．1．1 单抗的纯化结果

3．1．2 噬菌体测序展示出的一致序列

3．1．3 65DYRFHH88为构象表位

3．2 水禽细小病毒VP3蛋白重组腺病毒载体的构建

3．2．1 GPV和MDPV VP3基因的扩增

3．2．2 穿梭转移载体ps-GPV-VP3和ps-MDPV-VP3的鉴定

3．2．3 同源重组腺病毒pAd-GPV-VP3和pAd-MDPV-VP3的酶切鉴定

3．2．4 重组腺病毒转染HEK-293细胞

3．2．5 重组腺病毒表达鉴定

4 讨论

4．1 鹅细小病毒VP3蛋白表位的鉴定

4．1．1 表位鉴定实验方法的分析

4．1．2 蛋白表位鉴定结果分析

4．2 水禽细小病毒VP3蛋白重组腺病毒载体的构建

4．2．1 构建方法的分析

4．2．2 构建结果的分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文