苏云金芽胞杆菌碱耐受基因clpP和lytS的功能

摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)因其高效、安全和对环境友好等特点而成为世界上应用最为广泛的杀虫微生物。它在形成芽胞的同时可以在细胞中积累形成规则形状的晶体，其主要成份是杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs），并且在细胞裂解时随芽胞一起释放。在苏云金芽胞杆菌杀虫剂的生产过程中，这种伴胞晶体可以达到发酵产物干重的25％以上。由于昆虫中肠的碱性环境会对细菌与昆虫的互作产生影响，甚至影响到其致死效应，因此研究碱刺激下苏云金芽胞杆菌基因的表达调控机制具有十分重要的意义。本文比较了碱刺激对芽胞杆菌中的几种菌株和苏云金芽胞杆菌的的影响，并构建了与碱刺激相关的clpP基因和lytS基因缺失突变体，分析clpP基因和lytS基因的功能。
　　 本研究测定了芽胞杆菌族的枯草芽胞杆菌(Bs168)、蜡样芽胞杆菌(Bc ATCC14579)、苏云金芽胞杆菌HD73、YBT-1520、HBF-18、Bt22菌株在不同浓度的NaOH刺激下的生长情况，发现蜡样芽胞杆菌族细菌在碱刺激后，培养基pH值降低至8.9-9.1时可以恢复生长，而枯草芽胞杆菌则是培养基pH值降低至8.2-8.4时可以恢复生长，说明蜡样芽胞杆菌族对碱性环境适应能力强于枯草芽胞杆菌。
　　 采用同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD73菌株中clpP基因，构建了clpP基因缺失突变株HD△clpP。通过生长曲线的测定表明:在NaOH终浓度为24mM时，HD△clpP的生长速度与出发菌株HD73比无明显差异，但在将培养基中NaOH终浓度调节至30 mmol/L NaOH时，clpP基因缺失突变体的生长较出发菌株慢，说明ClpP在苏云金芽胞杆菌对碱性环境的适应过程中具有重要作用。芽胞计数和芽胞萌发实验分析显示，clpP基因缺失对芽胞形成率和萌发效率没有明显的影响;在NaCl终浓度为6％的盐刺激下HD△clpP的生长速率也较出发菌株慢，说明clp基因在盐协迫的条件下对菌株的生长具有重要作用。
　　 碱刺激下芯片结果表明:碱刺激诱导了大量运输、调节相关基因表达;其中被诱导超过10倍的基因有24个、被诱导超过4倍有136个、被诱导超过2倍表达的有320个、被抑制表达的基因有360个，大多数都是与生长相关的基因。其中lrgA、lrgB基因均被诱导表达80倍以上。
　　 采用同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD73菌株中可能调控lrgA基因的lytS基因，构建了lytS基因缺失突变株HD△lytS;生长曲线测定结果表明lytS基因的缺失对碱刺激的敏感性没有影响;构建了lrgAB基因启动子与lacZ融合表达载体并在野生型HD73和突变体HD△lytS测定了启动子活性，结果表明lrgAB基因转录受lytSR双组份信号系统调控。利用RealTimePCR分析了碱刺激下lrgAB基因的表达情况，结果与碱刺激下芯片的结果一致，均为碱刺激下诱导表达;芽胞计数实验表明lytS基因的缺失影响了芽胞产量。芽胞自溶性实验和胞外蛋白实验结果分析表明:lytS基因是通过改变菌体的自溶性影响芽胞产量。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 苏云金芽胞杆菌概述

1．1．1 苏云金芽胞杆菌

1．1．2 Cry蛋白杀虫机理

1．2 苏云金芽胞杆菌的应用

1．3 细菌的信号传导

1．3．1 单组份信号系统

1．3．2 双组份信号系统

1．3．3 ECF sigma factor

1．4 Caseinolytic protease基因(clpP)的研究进展

1．5 LytSR双组份信号系统的研究进展

1．6 立题依据与目的意义

1．6．1 立题依据

1．6．2 目的意义

2 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 菌株与质粒

2．1．2 培养基与抗生素

2．1．3 酶与生化试剂

2．1．4 引物序列

2．1．5 溶液和缓冲液

2．2 仪器设备

2．3 研究方法

2．3．1 PCR模板制备

2．3．2 PCR反应体系

2．3．3 PCR扩增程序

2．3．4 加“A”尾巴反应体系

2．3．5 重叠PCR扩增

2．3．6 碱刺激下对数生长期RNA的提取方法

2．3．7 RNA纯化

2．3．8 cDNA的合成

2．3．9 RealTime PCR反应体系

2．3．10 RealTime PCR扩增反应程序

2．3．11 酶切反应

2．3．12 琼脂糖凝胶电泳

2．3．13 大肠杆菌质粒提取

2．3．14 目的DNA的回收

2．3．15 DNA片段的连接

2．3．16 大肠杆菌热击感受态细胞的制备

2．3．17 大肠杆菌热击转化一氯化钙法

2．3．18 PCR扩增片断的克隆

2．3．19 苏云金芽胞杆菌电击感受态细胞制备

2．3．20 苏云金芽胞杆菌电击转化方法

2．3．21 序列的测定及分析

2．3．22 同源重组诱变过程及突变体的获得

2．3．23 碱刺激下生长曲线及细胞外pH变化分析

2．3．24 SDS-PAGE电泳

2．3．25 β-半乳糖苷酶活分析

2．3．26 活芽胞计数分析

2．3．27 苏云金芽胞杆菌芽胞的制备

2．3．28 苏云金芽胞杆菌芽胞萌发实验

2．3．29 菌株自溶性分析

2．3．30 细胞外蛋白分析

3 结果与分析

3．1 芽胞杆菌在不同浓度NaOH刺激下的生长情况

3．1．1 在pH9-pH12条件下Bt和Bs生长情况的比较

3．1．2 Bt、Bc、Bs菌株在不同浓度NaOH刺激下生长情况比较

3．2 clpP基因功能分析

3．2．1 clpP基因的生物信息学分析

3．2．2 clpP基因缺失片段的构建与鉴定

3．2．3 clpP基因缺失质粒的构建与鉴定

3．2．4 clpP基因缺失突变株的获得与验证

3．2．5 clpP基因缺失突变株对芽胞形成率的影响

3．2．6 clpP基因缺失突变体在不同pH下的萌发效率

3．2．7 clpP基因缺失在盐刺激下对菌株生长的影响

3．2．8 clpP基因缺失在碱刺激下对菌株生长的影响

3．3 Bt碱刺激下基因表达谱分析

3．3．1 RT-PCR确定碱刺激条件

3．3．2 提取RNA的鉴定

3．3．3 芯片杂交及结果扫描

3．3．4 基因表达谱数据分析

3．4 lytS基因功能分析

3．4．1 lrgAB基因结构分析

3．4．2 lytS基因缺失片段的构建与鉴定

3．4．3 lytS基因缺失质粒的构建与鉴定

3．4．4 lytS基因缺失突变株的获得与验证

3．4．5 lacZ融合分析lrgAB基因的转录活性

3．4．6 RealTime分析碱刺激下转录情况

3．4．7 lytS基因缺失突变株的菌落形态分析

3．4．8 lytS基因缺失对芽胞形成率的影响

3．4．9 菌株的自溶性分析

3．4．10 细胞外蛋白分析

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文