鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

摘要

CD3分子是T淋巴细胞的重要表面标志，在抗原识别中，CD3分子起着信号传递的重要作用，许多疾病的研究中都以它作为检测的重要指标。制备可用于分选和测定鹅体内CD3+T细胞群的特异性单克隆抗体，有助于了解鹅细胞免疫的功能及状态，为深入研究鹅的细胞免疫机理奠定一定的物质和理论基础。 本研究首先根据GenBank中绿头鸭CD3ε基因设计引物，利用RT-PCR方法首次克隆得到鹅CD3ε基因。并对克隆得到的序列进行了同源性分析、信号肽预测、糖基化位点的预测及不同物种间CD3ε链的进化树分析，证实克隆得到的序列为鹅CD3ε基因。 其次根据克隆鹅CD3ε基因序列设计特异性表达引物，将获得鹅CD3ε胞外区基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，并转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，间接免疫荧光结果显示，鹅CD3ε胞外区蛋白在真核细胞中获得表达。同时将鹅CD3ε胞外区基因亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中，并在大肠杆菌原核表达系统中进行表达，获得重组鹅CD3ε胞外区蛋白(rGoCD3ε)，利用镍柱对目的蛋白进行纯化，并以其为免疫原制备抗鹅CD3ε胞外区多克隆抗体。 最后本研究以重组质粒pcDNA3.1-CD3免疫BALB/c小鼠，免疫三次后，利用重组蛋白rGoCD3ε进行加强免疫，5天后取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以重组蛋白rGoCD3ε为检测抗原，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞株，同时利用细胞ELISA方法辅助筛选，并初步研究其部分生物学特性。结果共获得7株能够稳定分泌抗鹅CD3ε胞外区蛋白特异性单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。其中3株可与外周血淋巴细胞发生反应。单克隆抗体亚型鉴定结果显示，3株为IgM型，2株为IgG1型，1株为IgG2b型，1株为IgG3型。选择其中四株杂交瘤细胞株进行单抗腹水的制备，腹水效价在1∶3200至1∶3267800之间。Western blot结果表明，所制备的7株单抗均与14 kDa条带处的重组蛋白rGoCD3ε发生反应，间接免疫荧光试验结果显示，7株单抗均与瞬时转染pcDNA3.1-CD3的鸡胚成纤维细胞表达的鹅CD3ε胞外区蛋白发生反应并产生强荧光信号，进一步证明了单抗的特异性。 利用制备的3C11株和5A3株杂交瘤细胞株腹水与鹅外周血淋巴细胞反应，经与FITC标记羊抗鼠二抗反应后，流式细胞术分析结果显示，实验组出现了较明显的阳性峰。在经过DAPI染色后，利用激光共聚焦显微镜观察到外周血淋巴细胞的细胞膜处出现明显的荧光信号。 本研究制备的抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体为鹅T淋巴细胞的分离、免疫细胞的功能以及免疫调控机制、传染性疾病防制的免疫机理深入研究提供了一定条件。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 禽类T淋巴细胞表面主要CD分子概述

1．1．1 CD3分子

1．1．2 CD4分子

1．1．3 CD8分子

1．2 禽类CD3分子研究进展

1．2．1 CD3基因结构的研究

1．2．2 CD3分子结构的研究

1．2．3 CD3分子功能的研究

1．2．4 禽CD3+T细胞发育及分布

1．3 各种CD分子的单克隆抗体的应用

1．3．1 CD单抗在基础理论研究中的应用

1．3．2 CD单抗在检测技术中的应用

1．4 DNA免疫制备单克隆抗体的研究进展

1．4．1 DNA免疫的机制

1．4．2 DNA免疫的方法

1．4．3 DNA免疫的优点

1．4．4 DNA免疫的应用前景

1．5 研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 细胞及菌株

2．1．2 试验动物

2．1．3 试剂

2．1．4 主要溶液配制

2．1．5 细胞培养溶液

2．1．6 主要仪器

2．2 试验方法

2．2．1 鹅CD3ε基因的克隆与分析

2．2．2 鹅CDε胞外区基因的克隆、原核表达及抗原性鉴定

2．2．3 兔抗鹅CD3ε胞外区多克隆抗体的制备与鉴定

2．2．4 抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的制备

2．2．5 抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的鉴定

2．2．6 抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的初步应用

3 结果

3．1 鹅CD3ε基因的克隆及生物信息学分析

3．1．1 鹅CD3ε基因的克隆

3．1．2 鹅CD3ε基因的生物信息学分析

3．2 鹅CD3ε胞外区基因的克隆、原核表达及抗原性鉴定

3．2．1 鹅CD3ε胞外区基因的扩增与鉴定

3．2．2 鹅CD3ε胞外区基因原核表达载体构建

3．2．3 鹅CD3ε胞外区基因在大肠杆菌中的诱导表达及蛋白纯化

3．3 兔抗鹅CD3ε胞外区多克隆抗体的制备、鉴定及纯化

3．3．1 兔抗鹅CD3ε胞外区多克隆抗体效价的检测

3．3．2 兔抗鹅CD3ε胞外区多克隆抗体的纯化及其Western blot鉴定

3．3．3 兔抗鹅CD3ε胞外区多克隆抗体的间接免疫荧光分析

3．4 抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

3．4．1 抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的制备

3．4．2 杂交瘤细胞的鉴定

3．5 抗鹅CD3ε链胞外区蛋白单克隆抗体的初步应用

3．5．1 流式细胞术检测鹅CD3+T淋巴细胞

3．5．2 激光共聚焦法检测鹅CD3+T淋巴细胞

4 讨论

4．1 东北白鹅CD3分子ε链的克隆与分析

4．1．1 东北白鹅CD3分子ε链的克隆

4．1．2 东北白鹅CD3ε ORF的序列分析

4．2 东北白鹅CD3ε胞外区的表达及多克隆抗体的制备

4．3 单克隆抗体制备

4．3．1 免疫原的选择

4．3．2 杂交瘤细胞株的筛选方法

4．4 单克隆抗体的初步应用

4．4．1 流式细胞术检测鹅CD3+T淋巴细胞

4．4．2 激光共聚焦法检测鹅CD3+T淋巴细胞

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文