二倍体马铃薯的耐盐碱性及耐盐形态性状的QTL定位

摘要

盐渍化已成为困扰和威胁农业生产的世界性难题，通过在盐碱地上种植耐盐作物这种生物学改良方法，可以达到利用和改良盐碱地的目的。马铃薯是盐中度敏感作物，普通四倍体栽培种（Solanum tuberosum L.）亲本遗传基础狭窄，二倍体马铃薯中蕴含着非常有价值的基因，是拓宽现有遗传资源背景和培育耐盐品种的重要种质资源。因此，本试验对经十二次轮回选择适应长日照的原始二倍体栽培种富利亚（Solanum phureja，PHU）与窄刀薯(S.stenotomum，STN)杂种无性系(PHU-STN)的耐盐性、耐碱性及与耐盐形态性状相关的QTL进行了研究。研究结果对马铃薯的耐盐碱育种具有重要的理论和现实意义。 本研究在组织培养条件下，以PHU-STN杂种无性系试管苗为材料，通过NaCl胁迫，筛选对NaCl敏感度不同的二倍体马铃薯无性系;通过NaCl胁迫的盆栽试验，研究二倍体马铃薯在组培和盆栽试验条件下对盐敏感度的一致性;通过NaHCO3胁迫，进一步研究已筛选出的对NaCl敏感度不同的二倍体马铃薯无性系的耐碱性。通过SSR和AFLP分子标记技术，构建马铃薯分子遗传图谱，对马铃薯耐盐相关形态性状进行QTL初步定位，找到可靠性好的QTL，为马铃薯耐盐基因的精细定位和克隆提供理论与材料基础。主要研究结果如下: 1.利用80 mmol·L-1 NaCl胁迫含有166个二倍体马铃薯无性系（包括亲本和164个后代无性系）的PHU-STN杂种群体，以亲本为对照，根据形态性状表现，筛选出19个耐盐性强于耐盐亲本的无性系，1个耐盐性弱于感盐亲本的无性系，这些无性系是拓宽现有遗传资源背景和培育耐盐品种的重要种质资源。该PHU-STN杂种群体6个形态性状的广义遗传力值均大于0.9，说明这几个性状主要由遗传因素控制，受环境影响较小。 2.利用不同浓度（10，20和30 mmol·L-1）的NaCl胁迫不同盐敏感性的二倍体马铃薯无性系（包括根据形态性状筛选出的5个耐盐无性系、5个中度耐盐无性系、5个感盐无性系和它们的亲本），根据生理性状表现，得出如下结论: (1)10 mmol·L-1 NaCl胁迫使耐盐无性系的叶绿素含量和相对含水量升高，使感盐无性系的叶绿素含量和相对含水量下降;浓度大于20mmol·L-1NaCl胁迫时，不同盐敏感度的二倍体马铃薯的这两个性状值均下降。 (2) NaCl胁迫使不同盐敏感无性系的丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性和POD活性均升高，且浓度越大，这6个生理性状值越大。 (3) NaCl胁迫下，不同盐敏感无性系的叶绿素含量、相对含水量、脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD活性和POD活性相对值表现为，耐盐无性系＞中耐盐无性系＞感盐无性系，丙二醛含量相对值表现为，感盐无性系＞中耐盐无性系＞耐盐无性系，说明2个亲本和15个后代无性系在生理性状上所表现的对盐的敏感度与形态指标筛选的结果一致。 (4)所测生理性状对盐胁迫的敏感度不同，脯氨酸、丙二醛、SOD、可溶性糖较灵敏，可以作为评价二倍体马铃薯耐盐性优选生理性状;而30 mmol·L-1NaCl胁迫时，各生理性状与对照差异较明显，是评价二倍体马铃薯耐盐性比较适合的浓度。 3.在盆栽试验条件下，利用30和60 mmol·L-1NaCl胁迫不同盐敏感性的二倍体马铃薯无性系（包括2个耐盐无性系、2个中度耐盐无性系、2个感盐无性系和它们的亲本），所测生理性状表现说明，亲本和6个后代无性系在盆栽试验条件下表现出的对盐的敏感度与组培条件下一致，因此，在组培条件下评价二倍体马铃薯的耐盐性是可行的。 4.利用不同浓度（5和10 mmol·L-1）的NaHCO3胁迫不同盐敏感性的二倍体马铃薯无性系（包括5个耐盐无性系、5个中度耐盐无性系、5个感盐无性系和它们的亲本），根据形态性状和生理性状表现，得出如下结论: (1) NaHCO3胁迫使二倍体马铃薯无性系的生长受到抑制，胁迫浓度越大，抑制作用越强。 (2) NaHCO3胁迫使二倍体马铃薯无性系的叶绿素含量、可溶性糖含量和SOD活性降低，胁迫浓度越大，这3个生理性状值越小。 (3)5 mmol·L-1 NaHCO3胁迫时，耐盐无性系和中耐盐无性系的类胡萝卜素含量相对值大于100，感盐无性系的类胡萝卜素含量相对值小于100，耐盐无性系的相对含水量相对值大于100，而中耐盐无性系和感盐无性系的相对含水量相对值小于100;10mmol·L-1NaHCO3胁迫时，这2个性状的相对值进一步下降，且不同盐敏感无性系的的相对值均小于100。 (4) NaHCO3胁迫使二倍体马铃薯无性系的脯氨酸、丙二醛和可溶性蛋白含量升高，胁迫浓度越大，丙二醛含量和可溶性蛋白含量越大，而脯氨酸含量下降，但相对值仍然大于100。 (5)5 mmol·L-1 NaHCO3胁迫使耐盐无性系的POD活性降低，使感盐无性系的POD活性升高，NaHCO3胁迫浓度增大，不同盐敏感无性系的POD活性均升高。 (6)5 mmol·L-1 NaHCO3胁迫时，所测形态性状和生理性状表现说明，不同盐敏感无性系的耐碱性差异为，耐盐无性系＞中耐盐无性系＞感盐无性系。10mmol·L-1 NaHCO3胁迫时，除芽长外，其余性状的表现均说明，耐盐无性系的耐碱性＞中耐盐无性系和感盐无性系，而中耐盐无性系和感盐无性系耐碱性无差异。 (7)盐碱胁迫是两种性质不同的胁迫，碱胁迫对二倍体马铃薯生长的抑制作用明显大于盐胁迫。二倍体马铃薯在NaHCO3胁迫下的表现说明，耐盐二倍体马铃薯也耐碱，即耐盐性和耐碱性存在一定的相关关系。 5.利用JoinMap4.0软件对含有94个二倍体马铃薯无性系的群体进行连锁分析，得到一张包含16个主要连锁群的遗传连锁图，共计159个分子标记（140个AFLP标记和19个SSR标记），该连锁图覆盖基因组总长度为1093cM，标记间平均图距6.87cM，16个主要连锁群长度变化在10.06cM-138.27cM之间，平均长度为68.31cM，其中LG1最长，为138.27cM，LG8最短，为10.06cM。该连锁图为耐盐相关性状QTL的初步定位奠定了基础。 6.利用QTL IciMapping3.2软件，使用完备区间作图法，利用NaCl胁迫下6个形态性状相对值的表型数据，确定QTL以及对应的标记区间。共检测到与耐盐相关的4个形态性状的6个QTL位点。其中，qSL-1-1为控制芽长相对值的QTL，贡献率为10.25％; qSDW-14-1为控制芽干重相对值的QTL，贡献率为9.20％; qRFW-10-1、qRFW-10-2和qRFW-14-3为控制根鲜重相对值的QTL，贡献率分别为16.79％、10.83％和10.29％; qRDW-1-1为控制根干重相对值的QTL，贡献率为31.48％。贡献率最大的qRDW-1-1，可能是主效基因;另外， qSDW-14-1和 qRFW-14-3同时位于 LG14上标记 EACAMCAC307.5和EACAMCAC111.54之间的同一位置处，与标记EACAMCAC307.5紧密连锁，说明该区间存在一个主效基因或者几个紧密连锁的基因，该位点基因可能同时控制与耐盐相关的芽干重和根鲜重等数量性状。因此，本研究获得的与二倍体马铃薯耐盐相关的QTL，为分子标记辅助选择和QTL精细定位奠定了一定基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 盐分对植物的影响

1．1．1 盐分对种子萌发的影响

1．1．2 盐分对植物生长发育的影响

1．1．3 盐分对植物光合作用的影响

1．1．4 盐分对植物蛋白质合成的影响

1．1．5 盐分对植物脂类代谢的影响

1．2 盐胁迫对植物伤害的机理

1．2．1 离子毒害

1．2．2 离子胁迫对膜的伤害

1．2．3 矿质元素缺乏

1．2．4 渗透胁迫

1．3 植物耐盐机制

1．3．1 渗透调节

1．3．2 离子区域化

1．3．3 拒盐与离子的选择吸收

1．3．4 抗氧化酶的诱导

1．3．5 植物耐盐的分子机制

1．4 植物耐盐资源的评价

1．4．1 根据形态指标评价

1．4．2 根据生理生化指标评价

1．5 QTL定位的研究进展

1．5．1 QTL定位的原理

1．5．2 分子遗传图谱的构建

1．5．3 作图群体的建立

1．5．4 QTL定位的统计方法

1．6 马铃薯耐盐的研究进展

1．7 马铃薯分子遗传图谱构建及QTL定位的研究进展

1．8 本研究的目的和意义

1．9 本研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．2 试验方法

2．2．1 植物材料的获得

2．2．2 二倍体马铃薯的耐盐性形态鉴定

2．2．3 NaCl胁迫下二倍体马铃薯生理生化指标测定

2．2．4 盐胁迫盆栽试验

2．2．5 NaCO3胁迫下二倍体马铃薯的形态和生理生化指标测定

2．2．6 基因组DNA的提取及质量检测

2．2．7 SSR分析

2．2．8 AFLP分析

2．2．9 分子遗传图谱构建

2．2．10 QTL定位分析

2．2．11 数据统计与分析

3 结果与分析

3．1 80 mmol·L-1NaCl胁迫下二倍体马铃薯耐盐性评价

3．1．1 二倍体马铃薯种质资源的遗传表现

3．1．2 二倍体马铃薯耐盐资源和感盐资源筛选

3．1．3 6个形态指标的相关分析

3．1．4 聚类分析

3．2 不同盐敏感型二倍体马铃薯在NaCl胁迫下的耐盐性生理生化评价

3．2．1 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯叶绿素含量的影响

3．2．2 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯相对含水量的影响

3．2．3 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯丙二醛含量的影响

3．2．4 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯脯氨酸含量的影响

3．2．5 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯可溶性糖含量的影响

3．2．6 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯可溶性蛋白含量的影响

3．2．7 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯SOD活性的影响

3．2．8 NaCl胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯POD活性的影响

3．2．9 各生理性状在不同浓度NaCl胁迫下的表现

3．3 不同盐敏感型二倍体马铃薯在盆栽盐胁迫条件下的生理表现

3．3．1 盆栽条件下不同盐敏感型二倍体马铃薯叶绿素含量的表现

3．3．2 盆栽条件下不同盐敏感型二倍体马铃薯相对含水量的表现

3．3．3 盆栽条件下不同盐敏感型二倍体马铃薯丙二醛含量的表现

3．3．4 盆栽条件下不同盐敏感型二倍体马铃薯可溶性糖含量的表现

3．4 不同盐敏感型二倍体马铃薯在NaHCO3胁迫下的形态和生理表现

3．4．1 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯形态指标的影响

3．4．2 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯叶绿素含量的影响

3．4．3 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯相对含水量的影响

3．4．4 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯丙二醛含量的影响

3．4．5 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯脯氨酸含量的影响

3．4．6 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯可溶性糖含量的影响

3．4．7 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯可溶性蛋白含量的影响

3．4．8 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯SOD活性的影响

3．4．9 NaHCO3胁迫对不同盐敏感型二倍体马铃薯POD活性的影响

3．5 二倍体马铃薯分子遗传图谱的构建

3．5．1 盐胁迫下亲本及作图群体的形态性状表现

3．5．2 基因组DNA的提取

3．5．3 SSR和AFLP引物的筛选

3．5．4 群体SSR和AFLP分子标记的分析

3．5．5 分子遗传图谱构建

3．6 二倍体马铃薯耐盐相关形态性状的QTL分析

3．6．1 芽长相对值的QTL分析

3．6．2 芽干重相对值的QTL分析

3．6．3 根鲜重相对值的QTL分析

3．6．4 根干重相对值的QTL分析

4 讨论

4．1 NaCl胁迫下二倍体马铃薯耐盐性形态评价

4．2 NaCl胁迫下二倍体马铃薯耐盐性生理生化评价

4．2．1 利用叶绿素含量的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．2．2 利用相对含水量的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．2．3 利用丙二醛含量的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．2．4 利用脯氨酸含量的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．2．5 利用可溶性糖含量的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．2．6 利用可溶性蛋白含量的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．2．7 利用SOD活性和POD活性的变化评价二倍体马铃薯的耐盐性

4．3 二倍体马铃薯在组培和盆栽试验条件下对盐敏感度的一致性

4．4 NaHCO3胁迫下不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性表现

4．4．1 利用形态指标的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．2 利用叶绿素含量的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．3 利用相对含水量的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．4 利用丙二醛含量的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．5 利用脯氨酸含量的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．6 利用可溶性糖含量的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．7 利用可溶性蛋白含量的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．8 利用SOD和POD活性的变化评价不同盐敏感型二倍体马铃薯的耐碱性

4．4．9 二倍体马铃薯耐盐性与耐碱性

4．5 关于二倍体马铃薯分子遗传图谱的构建

4．5．1 作图群体的选择

4．5．2 标记类型的选择

4．5．3 分子标记的偏分离

4．6 关于二倍体马铃薯耐盐相关性状的QTL

4．7 本研究的创新点

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文