犬细胞免疫因子RT-qPCR检测方法的建立及应用

摘要

实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光探针或者荧光染料，利用荧光信号的积累，实时监测整个PCR的反应进程，通过制作出的标准曲线，对未知模版进行定量分析。因其具有操作简便、快速高效、高敏感性等特点，被广泛应用于分子诊断、分子生物研究、动物及食品安全检测等方面。
　　本实验分离了犬全血中的外周血淋巴细胞，通过PCR成功扩增出IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等几种细胞免疫因子的基因片段，连接pMD-18T载体，转化到DH5α感受态细胞中，在Amp抗性培养基上进行筛选、PCR和测序等验证，构建了标准品质粒。最后成功建立了检测犬全血中IL-4、1L-10、IL-13、IFN-α等细胞因子的实时荧光定量PCR的方法，该方法的模版在102～108拷贝/μL范围内呈现良好的线性关系，相关系数R2均达到0.992以上。利用该方法对犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)三联活疫苗免疫比格犬后的细胞免疫水平进行了评价。
　　实验结果显示:犬三联活疫苗免疫犬后，免疫犬外周血淋巴细胞与空白对照外周血淋巴细胞相比，IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等几种细胞免疫因子mRNA水平在3～14天之间均显著升高(p＜0.05);空白对照组的4种细胞免疫因子mRNA水平没有明显差异(p＞0.05)。
　　以上实验结果表明，本研究建立的实时荧光定量PCR方法确实可行，IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等细胞免疫因子可以作为细胞免疫评价指标之一。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 白细胞介素研究概况

1．2 干扰素研究概况

1．3 犬瘟热研究概况

1．4 犬细小研究概况

1．5 犬腺病毒研究概况

1．6 犬三联苗概述

1．7 研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验动物、细胞

2．1．2 主要试剂和仪器

2．2 实验方法

2．2．1 实时荧光定量PCR方法的建立

2．2．2 实时荧光定量PCR对犬三联活疫苗的免疫评价

3 结果与分析

3．1 实时荧光定量PCR方法的建立

3．1．1 IL-4实时荧光定量PCR方法的构建

3．1．2 IL-10实时荧光定量PCR方法的构建

3．1．3 IL-13实时荧光定量PCR方法的构建

3．1．4 IFN-α实时荧光定量PCR方法的构建

3．2 IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α实时荧光定量PCR对犬三联活疫苗的细胞免疫评价

3．2．1 PCR检测结果

3．2．2 间接免疫荧光检测结果

3．2．3 IL-4检测结果

3．2．4 IL-10检测结果

3．2．5 IL-13检测结果

3．2．6 IFN-α检测结果

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文