黑龙江省儿童和伴侣动物三种重要肠道原虫的分子流行病学研究

摘要

由寄生虫引起的疾病是全球感染性疾病的一个重要组成部分。一般在发达国家会引起人和动物相应的疾病，然而在发展中国家则主要引起感染甚至死亡。2004年，世界卫生组织报道由腹泻引起的疾病比其他一些疾病更困扰人们。许多种肠道寄生性原虫能引起人和动物的腹泻，甚至引发更严重的疾病，尤其是在免疫功能缺陷的群体中。隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫、蓝氏贾第虫是三种重要的引起人和动物腹泻的病原，一般在免疫功能正常的群体中主要引起自限性腹泻，而在免疫功能不全（HIV阳性患者）或者是免疫力低下的群体（如幼龄和老龄的人和动物）中会引起致死性腹泻。因此得到较为广泛的关注。
　　本实验采用巢式PCR（聚合酶链式反应）方法对来自黑龙江省哈尔滨市、大庆市的255份儿童粪便样本及哈尔滨市、大庆市和齐齐哈尔市的319份伴侣动物粪便样本（其中犬的粪便样本267份、猫的粪便样本52份）分别进行隐孢子虫、毕氏肠微孢子虫和蓝氏贾第虫基因扩增。通过SSU RNA（小亚基核糖体RNA）扩增来对隐孢子虫虫种进行鉴定，结果显示，本研究中猫和犬体内隐孢子虫的平均感染率分别为3.8％(2/52)和2.2％(6/267)。在猫的粪便样本中鉴定出两种隐孢子虫:猫隐孢子虫(C.felis(n=1))和微小隐孢子虫(C.parvum(n=1))，其中猫隐孢子虫和微小隐孢子虫感染率均为1.9％(1/52)，在犬的粪便样本中鉴定出两种隐孢子虫，分别为犬隐孢子虫(C.canis(n=5))和泛在隐孢子虫(C.ubiquitum(n=1))，其中犬隐孢子虫和泛在隐孢子虫的感染率分别为1.9％(5/267)和0.4％(1/267)。然而在被研究的儿童粪便样本中未发现隐孢子虫阳性样本。对毕氏肠微孢子虫的检测和分型则采用巢式PCR扩增ITS（转录间隔区），结果发现儿童总体感染率为7.5％(19/255)，其中哈尔滨市儿童感染率为11.9％(16/134)，大庆市儿童感染率为2.5％(3/121)。男性感染率为6.5％(8/124)，而女性感染率为8.4％(11/131)。4个腹泻样本感染率为25％(1/4)，而非腹泻样本感染率为7.2％(18/251)。由此可见，毕氏肠微孢子虫是引起腹泻的重要原因。随后对阳性样本进行测序分型共获得8种基因型包括3种已知的基因型CS-4(n=2)、EbpC(n=11)和Henan-Ⅳ(n=3)及5种新发现的基因型NEC1(n=1)、NEC2(n=1)、NEC3(n=1)、NEC4(n=1)和NEC5(n=1)，其中Henan-Ⅳ和NEC1、EbpC和NEC4分别在哈尔滨医院和小学样本中呈现混合感染。同时本研究结果显示在伴侣动物样本中，共发现毕氏肠微孢子虫阳性样本21个其中包括18个犬和3个猫，而在这些动物体内发现8种基因型，4种已知基因型D、EbpC、Ⅳ和PtEbⅨ，4种新发现的基因型分别命名为NED1至NED4。系统进化分析显示，在18个犬的样本中发现有人畜共患潜力的基因型D(n=1)、EbpC(n=2)、NED1(n=1)和NED2(n=1)及宿主特异性的基因型NED3(n=1)、NED4(n=1)和PtEbⅨ(n=14)，其中基因型EbpC和NED1、PtEbⅨ和NED3混合感染见于哈尔滨动物医院的样本中，而PtEbⅨ和NED4的混合感染出现在哈尔滨宠物市场样本中。在3个猫的样本中发现能造成人毕氏肠微孢子虫病的基因型D(n=2)和Ⅳ(n=1)。在伴侣动物和人的粪便样本中均发现的基因型为EbpC。
　　本实验利用巢式PCR方法对儿童和伴侣动物的样本进行贾第虫TPI（磷酸丙糖异构酶）基因的检测。在所有的儿童样本中均没有发现贾第虫阳性，在猫和犬的粪便样本样本中发现贾第虫感染率分别为1.9％(1/52)和4.5％(12/267)，共鉴定出3种集聚体类型(F、C和E)。其中集聚体F见于一个猫中而集聚体C(n=7)和E(n=5)被发现在12个犬中。
　　本实验在伴侣动物中鉴定出的隐孢子虫虫种C.canis、C.felis和C.parvum，毕氏肠微孢子虫基因型D、EbpC和Ⅳ以及贾第虫集聚体C在我国人体内都有感染的报道。在伴侣动物犬猫中发现的隐孢子虫虫种C.canis、C.parvum和C.ubiquitum，毕氏肠微孢子虫基因型D、EbpC和Ⅳ同时存在于我国的废水中。综上所述，伴侣动物可能是人隐孢子虫病、毕氏肠微孢子虫病和贾第虫病的贮存宿主和潜在的水污染的重要来源，伴侣动物可能是人感染的主要媒介，是人患疾病的重要的风险因素之一，它们可能会在人之间传播人畜共患病。因此，研究这三种原虫的流行情况和基因型分布对制定良好的预防措施、控制感染以及防止人畜共患病的暴发均有重要的意义。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 隐孢子虫

1．1．1 隐孢子虫和隐孢子虫病

1．1．2 隐孢子虫的生活史

1．1．3 隐孢子虫的分类

1．2 毕氏肠微孢子虫

1．2．1 毕氏肠微孢子虫的简介

1．2．2 毕氏肠微孢子虫的生活史

1．2．3 毕氏肠微孢子虫的检测

1．2．4 毕氏肠微孢子虫的基因分型和基因型

1．3 蓝氏贾第虫

1．3．1 贾第虫和贾第虫病

1．3．2 蓝氏贾第虫的生活史

1．3．3 蓝氏贾第虫的集聚体

1．4 研究的目的与意义

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 样本制备

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 方法

2．2．1 DNA提取

2．2．2 隐孢子虫虫种、贾第虫集聚体和毕氏肠微孢子虫的基因型的检测

2．2．3 PCR产物结果检测

2．2．4 PCR产物测序

2．2．5 测序结果的分析

2．2．6 统计学分析

2．2．7 系统进化分析

3 结果

3．1 粪便样本中隐孢子虫虫种的检测

3．2 粪便样本中毕氏肠微孢子虫的检测

3．2．1 粪便样本中毕氏肠微孢子虫的感染率

3．2．2 粪便样本中毕氏肠微孢子虫的基因型

3．3 粪便样本中贾第虫的集聚体检测

3．4 粪便样本中三种肠道原虫的感染情况

3．5 毕氏肠微孢子虫的系统进化分析

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文