产气荚膜梭菌NetB毒素阻断ELISA方法的建立与应用

摘要

产气荚膜梭菌(CP)是一种重要的人兽共患病病原体，广泛分布于自然界，可导致多种动物发生坏死性肠炎、肠毒血症以及人类的气性坏疽和食物中毒。迄今为止，已研究发现该菌能产生15种外毒素。NetB毒素是首次在坏死性肠炎(NE)病鸡体内分离的A型CP中发现的，NetB毒素在禽类NE的发病机制中是一种关键的致病因子。因此，研究该毒素蛋白的生物学功能及检测方法对CP的诊断和防治有重要的意义。
　　本文将CP NetB毒素蛋白表达产物经切胶纯化和复性后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，应用间接ELISA和Western blot方法对所制备的抗体进行检测。结果显示多抗血清效价达到1∶32768，且重组蛋白与制备的多克隆抗体发生特异性结合，具有良好的反应原性。将实验室保存的4株抗NetB毒素杂交瘤细胞株复苏并进行生物学活性分析，选择反应性好的单克隆抗体(McAb)F9G3株腹腔接种BALB/c小鼠成功进行了腹水的制备。
　　以纯化的CP重组NetB蛋白、兔抗CP NetB蛋白多抗和F9G3 McAb经三因素优化建立了检测CP抗体的阻断ELISA方法。优化后结果显示抗原最佳包被浓度为0.5μg/100μL，包被时间为4℃过夜;最佳封闭液为1％BSA，时间为37℃作用2h;待检血清的作用时间为1.5h;单克隆抗体的最佳工作浓度为0.0625μg/100μL，时间为37℃作用1 h;酶标抗体最佳稀释度为1∶5000，时间为37℃孵育1 h;最佳显色液作用时间为10 min。通过对90份CP阴性血清阻断ELISA检测结果进行统计学分析，确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥31.88％时为阳性，PI≤22.08％时为阴性，22.08％＜PI＜31.88％时为可疑。通过敏感性、特异性和重复性试验等证明此检测方法敏感性高、特异性强、可重复性好。通过对免疫鸡血清抗体效价消长规律的检测证明该方法的可靠性和准确性。利用此方法对342份临床血清样品进行检测，共有12份样品为CP NetB毒素抗体阳性，说明黑龙江省鸡场中存在产生NetB毒素的CP感染。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 不同类型产气荚膜梭菌研究进展

1．1．1 A型产气荚膜梭菌

1．1．2 B、C、D型产气荚膜梭菌

1．1．3 E型产气荚膜梭菌

1．2 鸡坏死性肠炎概述

1．2．1 α毒素与坏死性肠炎

1．2．2 NetB毒素与坏死性肠炎

1．2．3 鸡坏死性肠炎流行病学

1．2．4 鸡坏死性肠炎发病诱因

1．2．4 应激因素

1．2．5 鸡坏死性肠炎临床症状和病理变化

1．2．6 鸡坏死性肠炎的防治

1．3 产气荚膜梭菌的诊断技术

1．3．1 病原学诊断方法

1．3．2 分子生物学诊断方法

1．3．3 血清学诊断方法

1．4 研究目的和意义

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验动物和细胞

2．1．2 菌株、质粒及血清

2．1．3 主要分子生物学试剂

2．1．4 主要试剂的配制

2．1．5 仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 抗原制备

2．2．2 多克隆抗体制备和生物活性鉴定

2．2．3 单克隆抗体腹水制备和生物学活性鉴定

2．2．4 阻断ELISA方法的建立

2．2．5 阻断ELISA方法的特异性试验

2．2．6 阻断ELISA方法的灵敏度试验

2．2．7 阻断ELISA方法的重复性试验

2．2．8 重组NetB蛋白免疫鸡血清抗体效价动态变化检测

2．2．9 阻断ELISA方法对临床样品的检测

2．2．10 数据统计

3 结果

3．1 重组NetB毒素蛋白的诱导表达

3．2 多克隆抗体的制备及鉴定

3．2．1 NetB 多克隆抗血清的效价测定

3．2．2 多克隆抗体的Western blot检测

3．3 单克隆抗体腹水的制备和生物学活性鉴定

3．3．1 腹水的纯化

3．3．2 单克隆抗体浓度和效价的测定

3．4 阻断ELISA方法的建立与应用

3．4．1 阻断ELISA方法的优化

3．4．2 阻断ELISA方法的临界值的确定

3．4．3 阻断ELISA方法的灵敏性的试验

3．4．4 阻断ELISA方法的特异性试验

3．4．5 阻断ELISA方法的重复性试验

3．4．6 重组NetB蛋白免疫鸡血清抗体效价动态变化检测

3．4．7 阻断ELISA方法对临床样品的检测

4 讨论

4．1 腹水的制备与纯化

4．2 阻断ELISA方法的建立

4．3 阻断ELISA方法条件的优化

4．4 阻断ELISA方法特异性试验

4．5 阻断ELISA方法的应用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文