日本弓背蚁共生放线菌的多样性分析及抑菌活性研究

摘要

来源于微生物的活性物质长久以来作为前导化合物发挥显著作用。然而，随着半个多世纪以来人们对土壤和水体等一些趋同环境中环境微生物的大量筛选，导致我们获得的化合物往往是已知的。因此，很多学者建议从新生境中获得新菌种，发现新的活性物质。目前，国内外对昆虫共生放线菌及其产生化合物的相关研究表明，生活在这些特殊环境中的微生物能够合成多种新奇结构化合物，为发现新的微生物药物提供可能。本论文旨在从纯培养角度对日本弓背蚁体内及体表的放线菌进行多样性分析，以及抑菌活性初步筛选，以期挖掘更多的微生物新种以及具有生物活性的放线菌资源，为活性菌株次级代谢产物的后续研究打好基础。
　　本研究选用6种不同分离培养基对日本弓背蚁不同部位的共生放线菌进行系统分离，分析不同培养基以及蚂蚁不同部位的出菌率，对获得放线菌进行抑菌活性筛选，同时测定部分稀有菌株及部分活性较好的链霉菌的16S rRNA基因序列，并进行系统发育分析，将菌株归类到属，分析蚂蚁不同部位纯培养放线菌的多样性，取得的结果如下:
　　(1)本文选用6种不同分离培养基，对日本弓背蚁不同部位（表皮、头、胸和腹部）的共生放线菌进行系统分离，共得到124株可培养放线菌，去重复后得到116株。
　　(2)分析蚂蚁不同部位分离出的放线菌数量后发现，头部的出菌率最高，占67.2％，其次为表皮，胸部和腹部分离出的放线菌所占比例较小。
　　(3)对分离到的放线菌进行抑菌活性检测，共筛选得到活性菌株19株。其中，有16株对5种以上病原真菌表现出抑制活性（较强或较弱）;14株对5种以上病原真菌表现出较好的抑制活性（不包括弱活性）;10株对某种或某些病原真菌的抑菌率在50％以上。这些活性菌株主要分布在蚂蚁头部，其次分布在表皮部位。
　　(4)通过形态及部分菌株的16S rRNA基因分析后将这些菌株归类到8个属包括链霉菌属（Streptomyces），原小单孢菌属（Promicromonospora），小单孢菌属（Micromonospora），野野村氏菌属（Nonom uraea），疣孢菌属（Verrucosispora），栖植物菌属（Phytohabitans），小双孢菌属（Microbispora）及诺卡氏菌属（Nocardia）。其中，链霉菌属为优势菌属（占89.7％）。
　　(5)通过系统发育分析发现，链霉菌属内不同种间形成不同分支，表明了日本弓背蚁内共生链霉菌多样性较高。同时，隶属于不同菌属的稀有菌株之间也形成不同的分支，显示出了日本弓背蚁共生放线菌具备多样性。
　　(6)对菌株的16S rRNA基因序列进行分析后发现3个潜在新种，经多相分类学鉴定确定菌株1H-HV4为诺卡氏菌属的一个新种，命名为Nocardia camponoti;菌株1H-GS9为链霉菌属的一个新种，命名为Streptomyces formicae;菌株1C-HV12为原小单孢菌属的一个新种，命名为Promicromonospora alba。
　　从本文的内容中可以看出日本弓背蚁共生放线菌具有丰富的多样性，同时表现出很好的抑菌活性，在发现新型生物活性物质方面具有很大的潜力。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 昆虫共生微生物概述

1．1．1 昆虫共生微生物的定义

1．1．2 昆虫共生微生物的功能

1．1．3 昆虫共生微生物代谢产物研究

1．2 昆虫共生放线菌

1．2．1 昆虫共生放线菌对宿主昆虫的影响

1．2．2 昆虫共生放线菌次级代谢产物研究

1．3 日本弓背蚁(Camponotus janponicus Mayr)及其相关研究

1．4 研究的目的意义及内容

1．4．1 研究目的和意义

1．4．2 研究的内容

1．5 课题来源

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 蚂蚁样品

2．1．2 供试菌株

2．2 试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．3 主要培养基和配制方法

2．3．1 分离培养基

2．3．2 纯培养培养基

2．3．3 活性实验培养基

2．3．4 生理生化试验培养基

2．3．5 放线菌形态观察培养基

2．4 日本弓背蚁共生放线菌的分离与纯化

2．4．1 样品采样及预处理

2．4．2 日本弓背蚁共生放线菌的分离和纯化

2．5 蚂蚁共生放线菌抗真菌活性的初步筛选

2．6 共生放线菌新种的分类学鉴定

2．6．1 形态和培养特征鉴定

2．6．2 生理生化特征检测

2．6．3 化学分类学鉴定

2．6．4 分子水平鉴定

3 结果与分析

3．1 日本弓背蚁共生放线菌的分离及抑菌活性的初步筛选

3．1．1 日本弓背蚁共生放线菌的分离结果

3．1．2 日本弓背蚁共生放线菌抑菌活性的初步筛选结果

3．2 日本弓背蚁部分共生菌株的16S rRNA基因序列多样性分析

3．2．1 活性菌株的16S rRNA基因序列分析

3．2．2 稀有菌株的16S rRNA基因序列分析

3．2．3 日本弓背蚁共生放线菌的初步归类

3．2．4 日本弓背蚁共生放线菌的多样性分析

3．3 菌株1C-HV12的多相分类学鉴定

3．3．1 16S rRNA基因测序及系统发育分析

3．3．2 形态及培养特征

3．3．3 生理生化特征

3．3．4 细胞化学组分分析结果

3．3． 5菌株的(G+C)mol％含量测定结果

3．3．6 DNA同源性检测结果

4 讨论

4．1 日本弓背蚁共生放线菌的分离及多样性分析

4．2 日本弓背蚁共生放线菌抑菌活性研究

5 结论

5．1 本研究的主要结论

5．2 本研究的主要创新点及展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文