番茄灰霉侵染后番茄根内放线菌的差异研究及Dactylosporangium solaniradic的鉴定

摘要

植物在整个生长过程中常常会将许多营养物质分配至根部，因此吸引了大量微生物的聚集。这些微生物对植物的健康存在着很大影响，与宿主植物协同进化，并且建立了具有选择性互生的复杂和谐的微生态关系，其菌落结构与丰度的变化是植物是否健康的明显征兆。内生放线菌作为植物微生态系统中的天然组成部分，可通过自身的一些代谢产物或者借助相关的信号转导作用对植物生长产生影响。所以，研究番茄的不同生理状态与其内生放线菌的多样性和丰度的关系以及用内生放线菌防治番茄灰霉病具有重要的现实意义。
　　本研究样品选用相同番茄品种的灰霉菌侵染株和与其相邻的健康株的根部，采用植物表面消毒法、研磨法、稀释涂布平板法和分离纯化培养法，通过形态学和分子生物学分类初步分析它们根内可培养放线菌的多样性;采用平板对峙培养法分离、筛选对番茄灰霉病菌有抑制活性的内生放线菌，通过平板生长抑制法研究包括番茄灰霉病菌在内的11种病原真菌拮抗内生放线菌的广谱活性;对分离自病株番茄根部的菌株NEAU-FJL2进行多相分类学鉴定。主要结论如下:
　　(1)本研究通过对相同番茄品种的灰霉菌侵染株和与其相邻的健康株的根内放线菌的研究得到结论为:健康株根内的放线菌群落单一而菌株总体数量比较多，病株群落结构比较丰富但菌株总体数量比较少;健康株与病株没有分离到重复的菌株。表明番茄经灰霉菌侵染后，其根内可培养放线菌群落结构和丰度都发生了明显变化。
　　(2)通过平板生长抑制法，对131株菌进行拮抗番茄灰霉病菌的初筛，得到20株活性菌，其中13株分离于健康株，占比例为16.7％;7株分离于病株，占比例为12.1％。健康番茄根部所获得的内生放线菌拮抗灰霉菌的比例和数量高于病株。通过20株活性菌对其它10种真菌的拮抗测试，得到5株具有广谱拮抗活性的菌株，并分别测试了这5株菌的发酵浸提液对11种真菌的抗菌活性，均有不同程度的抗菌活性。
　　(3)对分离自病株番茄根内的菌株NEAU-FJL2进行多相分类学鉴定，其形态和化学分类特性都和指孢囊菌属的描述一致。菌株NEAU-FJL2的基内菌丝上有指状孢子;菌株NEAU-FJL2的细胞壁氨基酸成份为3-羟基-二氨基庚二酸;全细胞水解糖包含阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和甘露糖;含有的主要磷酸类脂为双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG);主要醌组为MK-9(H8)和MK-9(H6);主要脂肪酸为iso-C16∶0，C16∶1ω7c和iso-C15∶0;基因组(G+C) mol％含量为70.2±0.2 mol％。确定其分类学地位为，指孢囊菌属的一个新种，命名为Dactylosporangium solaniradicis。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 番茄灰霉病的危害

1．2 番茄灰霉病的综合防治

1．2．1 农业防治

1．2．2 化学防治

1．2．3 生物防治

1．3 植物内生放线菌在农业上的应用

1．3．1 在植物病害防治中的应用

1．3．2 在虫害防治中的应用

1．3．3 在其它有害生物中的防治应用

1．3．4 其它生物活性

1．4 病虫害侵袭植物与植物根招募微生物

1．4．1 病原菌侵染植物与根招募微生物

1．4．2 虫害侵袭植物与根招募微生物

1．5 研究的目的意义及内容

1．5．1 目的和意义

1．5．2 研究的内容

1．6 课题来源

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 番茄样品

2．1．2 供试靶标菌

2．1．3 PCR引物

2．2 主要试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 仪器

2．3 主要培养基和配制方法

2．3．1 分离培养基

2．3．2 纯化培养基

2．3．3 液体培养基

2．3．4 发酵培养基

2．3．5 生测培养基

2．3．6 生理生化测试培养基

2．3．7 形态观察培养基

2．4 方法

2．4．1 采样及处理

2．4．2 番茄根部内生放线菌的分离与纯化

2．4．3 菌种保藏及命名

2．5 番茄内生放线菌多样性初探

2．5．1 形态学分类

2．5．2 分子生物学分类

2．6 放线菌的抑菌活性测试

2．6．1 拮抗菌皿内初筛

2．6．2 灰霉菌侵染的病株与健康株活性菌数量比较

2．6．3 发酵产物抑菌作用

2．7 菌株NEAU-FJL2多相分类鉴定

2．7．1 形态和培养特征观察

2．7．2 生理生化特性测试

2．7．3 化学分类鉴定

2．7．4 分子水平鉴定

3 结果与分析

3．1 番茄内生放线菌多样性的初探结果

3．1．1 放线菌在不同样品上的分布情况

3．1．2 放线菌相对丰度分析

3．2 抑菌活性检测

3．2．1 拮抗菌皿内初筛结果

3．2．2 灰霉菌侵染的病株与健康株活性菌数量比较

3．2．3 发酵产物活性

3．3 菌株NEAU-FJL2的鉴定结果

3．3．1 16S rRNA序列分析及比对结果

3．3．2 系统发育树构建分析

3．3．3 形态观察

3．3．4 培养特征

3．3．5 生理生化特性

3．3．6 化学分类特征

3．3．7 (G+C)mol％结果

3．3．8 DNA同源性分析结果

4 讨论

5 结论

5．1 本研究主要结论

5．2 本研究的主要创新点

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文