棕榈酸和硬脂酸对HepG2细胞血红素加氧酶-1和核转录因子Nrf2表达的影响

摘要

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一类与脂质过氧化、胰岛素抵抗以及许多遗传易感因素密切相关的代谢应激性肝脏损伤性疾病。发生NAFLD时常伴随脂肪酸代谢异常，同时脂质代谢紊乱又是NAFLD的特征性表现，饱和脂肪酸棕榈酸(PA)和硬脂酸(SA)具有重要的生理功能，摄入适量具有调节肝脏脂质代谢，通过抑制氧化应激和炎症反应来预防或治疗NAFLD作用。
　　Nrf2是细胞抗氧化应激反应的关键因子，与抗氧化反应元件(ARE)相互作用，在细胞核内形成Keap1-Nrf2/ARE通路，诱导编码抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表达，在抗肿瘤、抗应激、调节GSH合成、抗凋亡、抗炎症反应、神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能，同时，Nrf2介导的抗氧化防御系统参与许多药物的代谢、解毒和运输。血红素氧合酶-1(HO-1)是Nrf2调控的下游靶基因之一，是机体重要的抗氧化应激酶，通过增加肝细胞的抗氧化应激能力，减轻肝脏损伤并在一定程度上延迟甚至是阻止非酒精性脂肪性肝炎的发生。
　　本试验采用脂质体介导法将Nrf2表达质粒和Nrf2-siRNA按其最适浓度瞬时转染入HepG2细胞中，构建稳定的Nrf2基因过表达和沉默模型。观察Nrf2增量和减量表达时，PA和SA作用HepG2细胞后，HO-1的mRNA和蛋白质表达量的变化。明确PA和SA刺激HepG2细胞后，Nrf2及其代谢酶HO-1的相关性。
　　经MTT法筛选确定PA和SA的诱导浓度为0.25 mM、0.5 mM、0.75 mM和1 mM。在1mmol/L浓度范围内，与对照组相比，PA和SA作用HepG2细胞后Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白质表达量均显著增加（P＜0.05），其中PA对Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白质的表达呈浓度依赖性，而SA对Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白质表达呈先增加后减少的趋势。Nrf2过表达后，随PA和SA浓度变化，HO-1mRNA和蛋白质表达量显著升高（P＜0.05）;而Nrf2沉默后，不同浓度PA和SA对HO-1mRNA和蛋白质表达量没有影响，并不受PA和SA浓度变化而影响（P＞0.05），提示在PA和SA代谢过程中Nrf2和HO-1具有一定的相关性。掌握PA和SA不同浓度时，Nrf2信号通路及其相关下游靶基因HO-1的变化规律，指导合理用药以及合理摄入相关脂肪酸来预防和治疗相关肝脏疾病，为Nrf2作为药物靶点奠定进一步的理论基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 非酒精性脂肪肝

1．1．1 胰岛素抵抗

1．1．2 氧化应激(OS)

1．1．3 脂质过氧化

1．1．4 炎症细胞因子

1．2 脂肪酸与非酒精性脂肪肝

1．2．1 脂肪酸

1．2．2 非酒精性脂肪肝与脂肪酸

1．3 Nrf2-Keap1抗氧化系统与NAFLD

1．3．1 Nrf2-Keap1系统

1．3．2 Nrf2与NAFLD

1．4 血红素加氧酶-1

1．4．1 HO-1研究进展

1．4．2 HO-1与Nrf2

1．4．3 HO-1与肝脏疾病

1．5 RNAi介导的基因沉默技术

1．6 研究目的和意义

2 材料和方法

2．1 试验材料

2．1．1 试验细胞

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 药品和试剂

2．1．4 溶液配制

2．2 试验方法

2．2．1 HepG2细胞复苏培养与冻存

2．2．2 PA和SA对HepG2细胞诱导浓度的选择

2．2．3 PA和SA及两者不同比例对HepG2细胞Nrf2和HO-1表达的影响

2．2．4 PA和SA对Nrf2过表达HepG2细胞HO-1表达的影响

2．2．5 PA和SA对Nrf2沉默HepG2细胞HO-1表达的影响

2．2．6 数据处理与统计学分析

3 结果与分析

3．1 PA和SA对HepG2细胞的形态的影响

3．2 不同浓度PA和SA对HepG2细胞的活性的影响

3．3 PA和SA及两者不同比例混合后对HepG2细胞Nrf2和HO-1转录的影响

3．3．1 不同浓度PA和SA对HepG2细胞中Nrf2基因转录的影响

3．3．2 不同浓度PA和SA对HepG2细胞中HO-1基因转录的影响

3．3．3 PA和SA以不同比例混合后对HepG2细胞中Nrf2和HO-1基因转录的影响

3．4 PA和SA及两者不同比例对HepG2细胞Nrf2和HO-1蛋白质表达的影响

3．4．1 不同浓度PA对HepG2细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达量的影响

3．4．2 不同浓度SA对HepG2细胞中Nrf2和HO-1蛋白表达量的影响

3．4．3 PA和SA以不同比例混合对Nrf2和HO-1蛋白质表达的影响

3．5 Nrf2基因沉默和过表达对HepG2细胞中HO-1表达的影响

3．6 两种脂肪酸对Nrf2沉默组HepG2细胞中HO-1表达的检测

3．6．1 PA和SA对Nrf2沉默组HepG2细胞中HO-1mRNA表达量的影响

3．6．2 PA和SA对Nrf2沉默组HepG2细胞中HO-1蛋白表达量的影响

3．7 两种脂肪酸对Nrf2过表达组HepG2细胞中HO-1表达的检测

3．7．1 PA和SA对Nrf2过表达组HepG2细胞中HO-1mRNA表达量的影响

3．7．2 PA和SA对Nrf2过表达组HepG2细胞中HO-1蛋白表达量的影响

4 讨论

4．1 脂肪酸与HepG2细胞系的选择

4．2 PA和SA对HepG2细胞活性的影响

4．3 PA和SA对Nrf2表达的影响

4．4 PA和SA对HO-1表达的影响

4．5 PA和SA以不同比例混合后对Nrf2及HO-1表达的影响

4．6 Nrf2沉默以及过表达后PA和SA对HO-1表达的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文