山羊胚胎附植阶段子宫转录组测序及附植相关基因的筛选

摘要

胚胎附植是指胚胎与母体子宫内膜接触并建立结构上的联系，从而实现物质交流的过程，在哺乳动物生殖过程中起到十分关键的作用。山羊（Capra hircus）属反刍动物，反刍动物胚胎为表面附植，即胚胎不侵入到子宫基质，而是与子宫内膜上皮细胞融合并形成子叶胎盘，通过胎盘实现胎儿与母体间的交流及物质交换。胚胎附植主要涉及胚胎滋养外胚层细胞和子宫内膜上皮细胞之间的相互作用，由于其表面附植的特点，使得山羊成为研究胚胎附植阶段母胎界面相互作用的有利模型。此外山羊作为世界上最古老的物种之一，是我国草食畜牧业的重要组成部分，在乳业、肉业、纤维等产业中具有不可忽视的地位。现代胚胎工程技术在山羊优良品种的繁育中已得到广泛应用，但操作过的胚胎在体内存活率与自然发育的胚胎相比降低很多，主要表现就是胚胎附植失败。胚胎附植需要胚胎与母体子宫间复杂的相互作用，子宫对于附植乃至妊娠成功都是至关重要的。因此，对山羊胚胎附植阶段子宫中基因表达情况进行研究，能够为提高山羊胚胎附植能力提供理论基础。
　　转录组是指特定组织或细胞在某一功能状态下转录出来的所有RNA总和，包括编码蛋白的mRNA和非编码RNA，转录组可以从整体水平上反应细胞中基因表达情况及其调控规律。反刍动物中，对绵羊和牛胚胎附植阶段转录组研究分析已有一部分进展。目前山羊全基因组序列已经获得，本文对胚胎附植阶段山羊子宫转录组进行了测序及分析，并从中发现一些可能参与山羊胚胎附植的关键基因，为深入了解山羊胚胎附植机制提供基础。
　　选取健康的黑龙江普通山羊，在妊娠第6(D6)、第16(D16)、第19(D19)天取子宫组织，每个时间点取三只羊以排除个体差异。RNA-Seq检测结果初步分析显示，妊娠第16天较第6天有1121个基因有差异，其中638上调，483下调;妊娠第19天较第6天有2555个差异基因，其中1183上调，1372下调;妊娠第19天较第16天有452个差异基因，其中124个上调，328个下调。通过GO分析发现差异基因主要与乳腺芽形态发生、dUMP代谢过程、糖原代谢过程调节、脱氧核糖核苷酸分解代谢过程、病毒包膜、CRLF-CLCF1复合物、神经介素B受体结合、类固醇21单加氧酶活性等有关，Pathway分析发现主要参与烟酸和烟酰胺代谢、RNA聚合酶、嘧啶代谢、糖脂生物合成以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成等途径。选择部分基因进行实时荧光定量PCR和原位杂交验证，验证结果与RNA-Seq结果一致。
　　结论:得到在山羊胚胎附植阶段差异表达的基因，荧光定量PCR和原位杂交验证测序结果可靠，得到的数据可以用于后续试验分析，为后续试验打下基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 山羊胚胎附植研究进展概述

1．1．1 山羊胚胎附植过程

1．1．2 参与胚胎附植的激素

1．2 RNA-Seq技术在胚胎附植研究中的应用

1．3 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物及处理

2．1．2 实验试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 山羊子宫组织转录组测序

2．2．2 差异表达分析

2．2．3 实时荧光定量PCR验证测序结果

2．2．4 原位杂交验证测序结果

3 结果

3．1 RNA-Seq结果分析

3．1．1 测序数据质量

3．1．2 基因结构分析

3．2 基因差异表达分析

3．2．1 差异表达基因趋势分析

3．2．2 GO分析

3．2．3 Pathway分析

3．3 实时荧光定量PCR验证RNA-Seq结果

3．4 原位杂交验证RNA-Seq结果

4 讨论

4．1 实验设计对测序结果的影响

4．2 测序得到的参与反刍动物胚胎附植的基因

4．2．1 粘附相关基因在胎附植阶段的作用

4．2．2 免疫相关基因在附植阶段的作用

4．2．3 激素合成酶在胚胎附植阶段的作用

4．3．4 细胞骨架相关蛋白在胚胎附植中的作用

4．3．5 细胞周期相关蛋白在胚胎附植中的作用

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文