组成型表达鸡传染性法氏囊病毒vp2基因重组乳酸菌的构建及免疫原性分析

摘要

传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病毒(IBDV)引发的一种鸡的免疫抑制性传染病，该病给养禽业造成了巨大的经济损失。本研究中，利用乳酸菌表达载体pPG612构建了表达IBDV免疫原性蛋白vp2的重组表达质粒，并分别在L.plantarum，L.pentoses，和L.casei393三株乳酸菌中进行表达。pPG612载体是一种表面展示载体，该载体中包含HCE组成型启动子和PgsA锚定蛋白，同时为了提高vp2蛋白的表达量，本研究在该载体中插入了T7g10增强子。本研究对高效制备表达vp2蛋白的阳性重组乳酸菌策略进行了改善，主要评价指标如下:OD600值处于0.4-0.5，重组质粒含量为2μl-6μl（100ng/μl），电压为2.3-2.4 kv/cm。结果显示，有两种重组质粒在三种乳酸菌中均表现出高电转化率，即(i) pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2，(ii) pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2，之后的酶切鉴定和PCR鉴定也都均证实了该结果。该方法较之前使用的构建重组乳酸菌的方法更加简单且更加高效。
　　本研究还分别对三株含有pPG612-vp2(pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1 T2)和pPG612-T7g10-vp2（pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2）重组质粒的重组乳酸菌作为口服疫苗的免疫原性和针对IBDV的保护率进行了评价。实验结果显示，vp2蛋白成功的获得了表达并展示在各重组乳酸菌的表面，将这些重组乳酸分别命名如下，LPL/pPG612-vp2(PL)，LPL/pPG612-T7g10-vp2(TL)，LPE/pPG612-vp2(PE), LPE/pPG612-T7g10-vp2(TE),LC/pPG612-vp2(PC)和LC/pPG612-T7g10-vp2(TC)。其中，含有pPG612-T7g10-vp2质粒的重组菌的vp2蛋白表达量较高，说明T7g10增强子能够有效提高vp2蛋白在乳酸菌中的表达水平。动物实验结果显示，口服免疫后，LPL/pPG612-T7g10-vp2株乳酸菌能够刺激机体产生更强的免疫反应以及更高的免疫保护率(87.5％)。通过本研究可以证明，重组乳酸菌系统作为口服疫苗可以刺激动物产生较强的抗体水平， pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1 T2免疫组产生的抗体水平显著高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫组，并且L.plantarum菌株免疫组的免疫保护率高于L.casei免疫组和L.pentoses免疫组。同时，L.casei免疫组的保护率高于L.pentoses免疫组。
　　动物实验中，在vp2免疫组中检测到大量的T细胞，在IBDV攻毒组中也检测到数量增多。与空白对照组相比，所有免疫组的CD4+和CD8+T细胞均显著性增高，其中pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫组的CD4+和CD8+T细胞比例高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫组。TL免疫组中CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率分别为13.3％和21.0％，高于PL免疫组的10.4％和14.0％; TC免疫组CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率分别为11.4％和20.9％，高于PC免疫组的7.2％和11.5％; TE免疫组CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率分别为8.3％和16.7％，高于PE组的7.5％和13.5％。所有免疫组的CD8+T细胞分化率均高于CD4+T细胞。CD8+T细胞属于细胞毒性T细胞，可以裂解感染病毒的细胞、肿瘤细胞和同种异体移植物，在免疫反应中发挥着关键作用。在细胞免疫反应的检测结果中，重组L.plantarum菌株免疫组的CD8+T细胞和CD4+T细胞的分化率高于重组L.casei菌株组和重组L.pentoses菌株组。pPG612-HCE-T7g10-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫组产生的IFN-γ，IL-2和IL-4细胞因子水平高于pPG612-HCE-PgsA-vp2-rrnBT1T2免疫组;其它数据显示，IFN-γ水平高于IL-2水平，IL-2水平高于IL-4水平;重组L.plantarum菌株免疫组较其他两个重组菌免疫组能够刺激产生更高水平的Th1和Th2型细胞因子，并且重组L.casei菌株免疫组刺激产生Th1和Th2型细胞因子水平高于重组L.pentoses菌株免疫组。IFN-γ和IL-2等Th1型细胞因子和细胞免疫相关，IL-4等Th2型细胞因子和体液免疫相关。本研究得出结论，含有pPG612-T7g10-vp2质粒的重组L.plantarum乳酸菌免疫原性强，能够针对IBDV提供有效的免疫保护，可作为将来开发IBDV口服疫苗的候选菌株。

目录

声明

摘要

Abstract

1 Introduction

1．1 Infectious Bursal Disease

1．1．1 Clinical Findings of IBD

1．1．2 VP2 as an antigenic component

1．1．3 Vaccinations progress against IBD

1．1 Lactobacillus an attractive expression system

1．1．1 Bacteriophage T7 gene 10 derived(RBS) translational enhancer

1．1．2 Electro-transformation efficient tool for plasmid DNA uptake

1．2 Advantages of mucosal immunization

1．3 Objective of this study

2 Materials and Methods

2．1 Materials

2．1．1 Bacterial strains and plasmids

2．1．2 Virus

2．1．3 Experimental Animals

2．1．4 Antibodies and Test Kits

2．1．5 Primers

2．1．7 Chemical reagents

2．1．8 Medium and antibiotic

2．1．9 Instrument and equipment

2．2 Method

2．2．1 Cloning and sequencing of vp2 gene

2．2．2 Activation of bacteria

2．2．3 Vp2 gene amplification

2．2．4 Gene extraction and ligation of vp2 with pMD18-T simple vector

2．2．5 Heat shock transformation method

2．2．6 Screening and identification of recombinant strains

2．2．7 Engineering of expression vector

2．2．8 Preparation of competent cells and bacterial electroporation

2．2．9 Expression of recombinant protein and identification by SDS-PAGE and Western blot

2．2．10 Identification of vp2 surface expression by immunofluorescence

2．2．11 Propagation of IBDV

2．2．12 Immunization

2．2．13 Determination of antibody by ELISA

2．2．14 Detection of lymphocytes proliferation

2．2．15 Statistical analysis

3 Results

3．1 Vp2 amplification and cloning results

3．1．1 PCR amplification result of target vp2 gene

3．1．2 Recombinant plasmid pMD18-TS-vp2 result

3．1．3 Confirmation result of pMD18-TS-vp2 by single and double digestion

3．2 Construction and identification result of recombinant expression vector

3．2．1 Engineering of expression vector

3．2．2 Identification of recombinant expression plasmids by enzyme digestion and PCR assay

3．2．3 Electrotransformation result of recombinant expression plasmid into Lactobacillus strains

3．2．4 Comparison of old and improved method

3．3 immunofluorescence resuits of vp2 surface expression

3．4 SDS-PAGE and Western blot result

3．5 Antibody titire and stimulation of humoral immune response

3．6 Detection of Th1 and Th2 type immune response

3．6．1 Lymphocytes proliferation

3．6．2 Detection of cytokines-based immune response

3．7 Protective efficacy against IBDV challenge

4 Discussion

4．1 Competent cells preparation of Lactobacillus strains

4．2 DNA-based vaccines induce cellular and humoral immune responses

4．3 Expression of vp2 protein on the cell surface using HCE-PgsA system

4．4 Comparison of vp2 protein expression using translational enhancer T7g10

4．5 Humoral immune response against IBDV

4．6 Cellular immune response mediated by T cells

4．7 Th1 and Th2 cytokines immune responses

5 Conclusions

Acknowledgment

References

Appendix

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