芦丁干预猪链球菌生物被膜形成对荚膜多糖含量和结构的影响

摘要

2型猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是一种重要的人兽共患病病原菌，形成生物被膜(biofilm，BF)后，细菌群体耐药性极强，在感染处难以全部清除，致使感染迁延不愈，因此，怎样抑制生物被膜形成以及减少生物被膜感染是兽医临床急需解决的难题，已成为海内外研究人员关注的重点。2型猪链球菌生物被膜的形成过程非常复杂，其经过黏附、聚集、成熟、脱落后再次循环的过程，在细菌经过24 h培养后完成黏附过程，在60～72h生物被膜成熟。黏附是生物被膜形成的第一步骤，并且是干预生物被膜的形成及减少生物被膜感染的关键环节。荚膜多糖作为2型猪链球菌的毒力因子，不但有抗吞噬、黏附和定植的作用，还可以调控黏附影响猪链球菌生物被膜的形成。当荚膜多糖的含量下降时，促进了生物被膜的形成，但其结构改变对生物被膜影响尚不清楚。
　　芦丁(rutin)是黄酮类化合物，在自然界中普遍存在，具有多方面的生物活性，价廉易得。而且本实验室前期发现丁香叶水提物对猪链球菌生物被膜具有很好的干预作用。通过灰色关联度和谱效关系分析，确定丁香叶中发挥作用的主要活性成分为芦丁，但其对荚膜多糖含量和结构的影响尚不清楚。故本试验从荚膜多糖角度出发，在黏附阶段，研究其含量、结构变化与干预猪链球菌生物被膜形成的关系。
　　在芦丁干预下，在猪链球菌生物被膜形成的黏附阶段，通过离心法和酶解法提取荚膜粗多糖，采用Sepharcryl S-300凝胶渗透层析柱纯化荚膜粗多糖后，通过苯酚-硫酸法测得对照组与芦丁组荚膜多糖的含量分别为50.54±2.69％和60.46±4.91％，芦丁干预猪链球菌生物被膜后荚膜多糖的含量显著升高(P＜0.05)。
　　经过薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)分析，对照组与芦丁组荚膜多糖均含有半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcN)、鼠李糖(Rha)和唾液酸(Neu5Ac)。对照组单糖的摩尔数比为:Rha∶ Gal∶ Glc∶ GlcN=1∶2.12∶1.09∶0.71，芦丁组单糖的摩尔数比为:Rha∶ Gal∶ Glc∶ GlcN=1∶2.26∶0.95∶0.73，芦丁干预猪链球菌生物被膜后荚膜多糖的单糖摩尔比值差异不显著(P＞0.05)。
　　通过核磁共振光谱(NMR)对对照组和芦丁组荚膜多糖与其对应脱唾液酸后的产物进行分析，结果显示对照组与芦丁组荚膜多糖的1H-NMR图谱相同，其脱唾液酸荚膜多糖产物的1H-NMR图谱也相同，说明芦丁干预猪链球菌生物被膜后与对照组相比荚膜多糖结构未发生改变。
　　综上所述，芦丁在黏附阶段干预猪链球菌生物被膜后，导致荚膜多糖含量升高，降低了生物被膜的形成，故其是猪链球菌生物被膜形成的黏附抑制剂。

目录

声明

论文说明

摘要

1 引言

1．1 细菌生物被膜概况

1．1．1 细菌生物被膜定义和组成

1．1．3 细菌生物被膜形成机制

1．1．4 细菌生物被膜检测方法

1．1．5 细菌生物被膜耐药机制

1．2 猪链球菌生物被膜

1．2．1 猪链球菌生物被膜的研究进展

1．3 细菌荚膜多糖研究进展

1．3．1 细菌荚膜多糖概述

1．3．2 细菌荚膜多糖功能与应用

1．3．3 猪链球菌荚膜多糖研究进展

1．3．4 荚膜多糖与生物被膜之间的关系

1．4 芦丁研究进展

1．4．1 芦丁的理化性质

1．4．2 芦丁的药理作用研究

1．5 研究目的及意义

2 材料方法

2．1 材料

2．1．1 菌株

2．1．2 药物

2．1．3 试验试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 猪链球菌ATCC700794生物被膜形成周期的测定

2．2．2 猪链球菌荚膜多糖的提取

2．2．3 芦丁对猪链球菌荚膜多糖含量和组成分析

2．2．4 芦丁对荚膜多糖结构的分析

2．2．5 数据处理

3 结果

3．1 猪链球菌ATCC700794生物被膜形成周期结果

3．2 芦丁对荚膜多糖含量的影响

3．2．1 荚膜粗多糖凝胶渗透柱层析结果

3．2．2 荚膜多糖纯度测定

3．2．3 荚膜多糖的含量测量

3．3 芦丁对荚膜多糖单糖组成的影响

3．3．1 荚膜粗多糖的薄层色谱结果分析

3．3．2 荚膜多糖的柱前衍生液相色谱法结果分析

3．3．3 荚膜多糖中唾液酸测定结果

3．4 芦丁对荚膜多糖结构的影响

4 讨论

4．1 黏附期的确定

4．2 芦丁对猪链球菌荚膜多糖含量的影响

4．3 芦丁对猪链球菌荚膜多糖组成的影响

4．4 芦丁对猪链球菌荚膜多糖结构的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文