大豆菌核病生防放线菌的筛选及Micromonospora parathelypteridis新种的鉴定

摘要

大豆菌核病是由土传性病原真菌核盘菌引起的，该菌株的寄主范围较广泛，可以侵染400多种植株，广泛分布于全球各地。由于其可以产生一种休眠体组织菌核，可以长时间存留在土壤中，因此难以得到有效控制。大豆是我们国家的重要农作物，深受菌核病的危害导致每年产量大幅度降低。目前对于该疾病的防治主要以化学制剂为主，但由于化学试剂的使用导致成本的不断提高且对环境的严重危害，使得其无法在实践中更好的得以利用。相比而言，生物防治具有安全可靠、低毒无害等优点，因此采用生物防治的方法来控制大豆菌核病具有十分重要的意义。
　　本研究选取了5种高效的筛选培养基对大豆健康植株和感染菌核病的病态植株的根部内生菌进行了分离，将获得的菌株通过培养特征、形态特征的观察后去重，对各样品分离获得的菌落数、菌株数进行统计分析比较。然后利用大豆菌核病的病原真菌作为供试菌株，将分离得到的大豆根部内生放线菌分别进行体外平板抑菌活性以及发酵液抑菌活性的测定，结合大豆苗期试验，对获得的拮抗菌株的抗病、促生、定殖能力进行评估。然后对拮抗菌进行分子生物学、形态培养特征、生理生化特性的描述，为今后大豆菌核病的生物防治提供新资源。此外，本实验还对一株小单孢菌属的稀有放线菌进行了多相分类学鉴定，丰富了微生物资源库。结果如下:
　　(1)健康植株以及感病植株大豆根部共筛选得到放线菌1574株，分离自健康植株的菌落数显著高于病态植株。而后将获得的菌株经排重后获得70株不同的放线菌，其中15株内生放线菌仅分离自健康植株，27株内生菌仅分离自感病植株，28株放线菌为健康植株与病态植株共有放线菌，表明经大豆菌核侵染后根部菌群的多样性有所提高。
　　(2)对全部经分离纯化的70株菌株均进行了体外抑菌活性试验，5株放线菌对大豆菌核病病原真菌的菌丝的生长存有抑制作用，这5株菌中有2株(ZGS1-10和ZBCPA2-13)为健康植株与感病植株共有放线菌，抑菌率从20.9％到22.4％，另外3株(ZBDPA2-2、ZBAAG12-4和ZBAAG3-15)均分离自病态植株，抑菌率从28.3％到58.5％，其中ZBDPA2-2对大豆菌核病的抑菌效果最强，抑制率可达58.5％，并且对其他检测的11种真菌也均存在抑菌活性。
　　(3)大豆苗期试验表明，当ZBDPA2-2的接种浓度达到1.0×106 cfu·g-1-1.0×107 cfu·g-1时，可以明显降低大豆菌核病的发病率以及病情指数，对大豆离体叶片的发病指数也有减弱作用，且对大豆幼苗植株的鲜、干重，根鲜、干重，根长和株高均存在不同的促进作用，并且可以长期稳定的定殖于大豆植株的根表，但无法很好的定殖于大豆的根组织内部。
　　(4)通过分子生物学分析、形态特征培养观察、生理生化特性的比较，对ZBDPA2-2进行了初步的特征描述，发现其在多处均不同于相似菌株，并确定该菌株属于链霉菌属。
　　(5)本实验对一株稀有放线菌NEAU-JXY5T进行了多相分类学鉴定。经16S rRNA和gyrB基因序列的分析发现，菌株NEAU-JXY5T与多个小单孢菌属的典型菌株的相似度很高，且始终在一个进化分支上，但经过形态培养特征、生理生化特性、细胞化学组分等的分析比较，其符合小单孢菌属的典型特征但又显著区别于其他相似度较高的菌株，且DNA同源性分析结果表明，菌株NEAU-JXY5T与其他检测菌株的同源性均在70％以下，从而确定了菌株NEAU-JXY5T为小单孢菌属的一个新种，命名为Micromonospora parathelypteridis。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 大豆菌核病的研究进展

1．1．1 大豆菌核病病原真菌简介

1．1．2 大豆菌核病病原真菌的生物学特征

1．1．3 大豆菌核病病原真菌致病机理

1．1．4 大豆菌核病的病症及分布

1．2 大豆菌核病的防治

1．2．1 大豆菌核病的农业防治

1．2．2 大豆菌核病的化学防治

1．2．3 大豆菌核病的生物防治

1．3 植物内生放线菌的生物学功能

1．3．1 植物内生放线菌

1．3．2 植物内生放线菌抗病害作用

1．3．3 植物内生放线菌促进植物生长作用

1．4 研究目的意义及内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 分离样品及供试大豆品种

2．1．2 供试菌株

2．2 试剂与仪器

2．2．1 试剂

2．2．2 主要仪器

2．3 主要培养基及制备方法

2．4 大豆样品根部内生放线菌的分离纯化

2．4．2 放线菌的分离培养

2．4．3 菌种的保藏方法

2．5 放线菌抑菌活性检测

2．5．1 筛选菌株的发酵液培养

2．5．2 抑制细菌活性检测

2．5．3 抑制真菌活性检测

2．6 放线菌的抗病促生能力评估

2．6．1 放线菌的防效检测

2．6．2 放线菌的促生能力

2．7．1 形态和培养特征鉴定

2．7．2 生理生化特性鉴定

2．7．3 化学分类学鉴定

2．7．4 分子水平鉴定

3 结果与分析

3．1 放线菌的分离结果与分析

3．2 抑菌活性的测定

3．2．1 抑制真菌活性检测

3．2．2 抑制细菌活性检测

3．3 拮抗菌的抗病促生能力评估

3．3．1 拮抗菌的抗病能力

3．3．2 拮抗菌的促生能力

3．3．3 拮抗菌在大豆根部定殖能力

3．4 拮抗菌的性质描述

3．4．1 16S rRNA序列测定与系统发育分析

3．4．2 形态及培养特征

3．4．3 生理生化特性

3．5 Micromonospora parathelypteridis的多相分类学鉴定

3．5．1 16S rRNA和gyrB基因的测序及系统进化分析

3．5．2 形态、培养特征及抑菌活性

3．5．3 生理生化特征

3．5．4 化学分类特征

3．5．5 (G+C)mol％的测定

3．5．6 DNA同源性分析

4 讨论

4．1 发病植株对活性微生物的招募作用

4．2 菌株定殖能力与抗病作用的关系

4．3 ZBDPA 2-2生物潜能分析

4．4 小单孢菌属(Micromonospora)的新种鉴定

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文