基于阿特拉津降解菌构建功能菌剂及其原位修复污染土壤研究

摘要

东北地区是我国玉米种植的主要地区，阿特拉津作为玉米农田中常用的除草剂，由此导致大量的阿特拉津进入东北黑土农田生态系统，对黑土质量构成极大的威胁。如何在保证农业生产的同时又安全有效的解决残留于土壤环境中的阿特拉津，消除其对环境潜在威胁已成为亟待解决的问题。目前，原位生物修复法被认为是去除土壤中阿特拉津最为有效的方法。此外，相关研究报道，土壤中重要的组成部分—腐殖酸作为一种天然表面活性剂在调节微生物的活性功能方面具有一定的作用。针对上述现实问题与研究进展，本文在探讨腐殖酸强化实验室前期所分离的菌株DNS10降解阿特拉津的生物学机制的基础上，重点构建并优化含有腐殖酸的功能菌株菌剂制备载体材料，并深入探讨了功能菌剂的农田原位环境中的应用技术，以期为阿特拉津污染农田土壤的原位生物修复提供必要的技术支撑与理论基础，主要的研究内容与相应结论概括如下:
　　本文着重研究了阿特拉津降解菌株DNS10对于外源腐殖酸添加的响应特征。测定了不同添加量（100 mg·L-1-800 mg·L-1）腐殖酸对菌株DNS10生长以及降解能力的影响。在此基础上，采用相对定量PCR的方法考察了腐殖酸对于菌株DNS10降解基因表达量的调控规律。研究结果表明，腐殖酸添加能够促进降解菌DNS10的生长并提高菌株对阿特拉津的降解速率。当腐殖酸添加浓度达到400 mg·L-1时，菌株DNS10能够在36 h就能够将溶液中初始浓度为100 mg·L-1的阿特拉津完全降解。而未添加腐殖酸的对照处理经过48 h培养，溶液中仍有15.82％的阿特拉津剩余（阿特拉津初始浓度为100 mg·L-1）。腐殖酸能够促进菌株DNS10中阿特拉津降解基因表达，经过36h的培养，投加腐殖酸的处理中降解trzN的表达量较空白处理相比最高可提升了6.58倍。
　　采用RNA-Seq测序技术，考察腐殖酸添加前后菌株DNS10关键功能基因转录差异情况，进而探讨腐殖酸添加对菌株DNS10的GO功能以及基因KEGG pathway产生的影响。结果表明:腐殖酸添加后，菌株DNS10内共有140个基因的表达量出现差异。其中上调基因78个，下调基因62个。对差异基因进行GO富集分析，发现“精氨酸生物合成”、“谷氨酰胺家族氨基酸生物合成”以及“精氨酸代谢”的相关基因发生上调，这可能有助于提高菌株对于阿特拉津耐受能力，促进细菌生长。KEGG富集分析结果与GO富集分析结果一致。
　　为了将降解菌应用于实际土壤修复过程中，构建并优化对降解菌能够起到保护作用的载体。选用凹凸棒土、膨润土以及廉价高腐殖酸含量的草炭土为载体材料，采用正交实验法构建并优化菌株DNS10的载体材料配比。结果表明:当载体配比为草炭土1.0∶凹凸棒土0.5∶膨润土1.0(A2B2C3)时，室温放置30 d后菌株存活率最高(68.48％)。此外，上述配比载体对菌株DNS10表现出较好的紫外条件保护作用，经紫外线照射80 min后，载体中功能菌株存活率仍能保持60％以上。选择效果较好的两种处理以及菌液进行土壤修复处理，以A2B2C3比例构建菌剂材料投加土壤后，土壤中阿特拉津生物降解最快，28 d时降解率可达95.89％。通过对土壤中atzB和atzC定量研究发现，A2B2C3组添加后，atzB和atzC表达情况优于其他处理。
　　采用盆栽培养方式，分别研究玉米在未污染土壤（空白处理）、阿特拉津污染土壤（污染处理）以及添加修复菌剂污染土壤（修复处理）中生长、叶绿素含量、叶片MDA含量以及阿特拉津在体内分布情况。结果表明，经过21d的培养，污染处理玉米幼苗生物量明显低于空白处理，而修复处理与空白处理无明显差异。阿特拉津会降低玉米幼苗叶片叶绿素含量产生影响，21 d时污染处理叶片中叶绿素含量与空白和修复相比分别降低了4.58％和3.32％，其对叶绿素a影响更为明显，仅为空白和修复处理含量的87.59％和94.67％。各处理玉米根和叶中阿特拉津积累量大于茎，修复处理中各部分阿特拉津含量均低于污染处理。与污染处理相比，修复处理根、茎和叶中阿特拉津含量分别降低了22.29％、43.21％以及31.82％。
　　以前期优化的草炭土、凹凸棒土和膨润土为主要基质，以除草剂阿特拉津降解菌DNS10为活性成分所制备出的微生物菌剂在农田土壤中作为追肥施用后，可增加土壤处理中长残留除草剂阿特拉津的消减速率，同时显著的增加玉米的产量，其中菌剂投加量为10 kg·亩-1时，其增产效果最显著，产量增幅达13.92％。此外，微生物菌剂还能够增加有机质、铵态氮以及速效钾等土壤养分含量。通过纯培养方式，发现微生物菌剂在提升作物产量的同时，还能明显的改变农田土壤中的微生物区系，显著的增加土著关键功能微生物，如固氮细菌、氨氧化细菌和硝化细菌等参与土壤氮素循环的关键微生物的数量。与未投加菌剂的土壤相比，上述功能细菌可培养数量在玉米收获期最多分别增加了266.67％、190.91％以及520.75％。采用高通量技术研究菌剂对于土壤微生物群落结构影响，发现菌剂能够提高土壤细菌群落结构多样性，门水平下土壤中主要菌群Proteobacteria（变形菌门）、Acidobacteria（酸杆菌门）、Actinobacteria（放线菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Firmicutes（厚壁菌门）、Planctomycetes（浮霉菌门）、Lactococcus_piscium（芽单胞菌门）以及Chloroflexi（绿弯菌门）。阿特拉津添加后，土壤中厚壁菌门所占比例明显增加。PCA分析结果表明造成微生物群落结构改变的主要因素可能是阿特拉津以及菌剂的添加。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 阿特拉津概述

1．1．1 阿特拉津使用及污染情况

1．1．2 阿特拉津对动植物的危害

1．1．3 阿特拉津污染微生物修复研究进展

1．2 腐殖酸在土壤有机污染修复中的作用

1．2．1 腐殖质及腐殖酸

1．2．2 腐殖酸去除土壤有机污染

1．3 污染土壤修复技术概述

1．3．1 工程修复技术

1．3．2 生物修复技术

1．3．3 物理-化学修复技术

1．3．4 联合修复技术

1．4 微生物分子生物学技术及其在土壤污染与修复中的作用

1．4．1 荧光原位杂交技术

1．4．2 末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)

1．4．3 RAPD技术及其应用

1．4．4 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1．4．5 实时荧光定量PCR(Q-PCR)

1．4．6 细菌转录组学研究

1．4．7 宏基因组学

1．5 研究目的意义与内容

1．5．1 研究意义与主要内容

1．5．2 技术路线

1．5．3 课题来源

2 材料与方法

2．1 试验材料与仪器

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验药品

2．1．3 试验仪器

2．1．4 试验用培养液

2．2 测定方法

2．2．1 不同样品中阿特拉津含量测定

2．2．2 外源物质对培养液中阿特拉津回收率的影响

2．2．3 纯培养菌株生长量及菌剂生物量测定

2．3 外源物质对菌株DNS10生长、降解及功能基因表达量的影响

2．3．3 腐殖酸添加前后菌株DNS10转录组差异分析

2．4 基于腐殖酸构建优化阿特拉津降解菌剂载体

2．4．1 载体材料配比优化

2．4．2 紫外条件下不同配比载体对功能菌株的保护作用

2．5 菌制剂盆栽修复污染土壤研究

2．5．1 菌剂对阿特拉津污染土壤修复效果

2．5．2 土壤中阿特拉津解基因表达情况的影响

2．6 菌剂对阿特拉津胁迫条件下玉米典型生物学特性的影响

2．6．1 根长、株高、生物量、根冠比

2．6．2 玉米植株叶绿素和MDA含量差异

2．6．3 玉米植株不同部位阿特拉津积累情况

2．7 功能菌剂制备及其原位修复污染土壤技术研究

2．7．1 功能菌剂制备

2．7．2 基于功能菌剂原位修复农田土壤技术研究

2．7．3 功能菌剂原位修复效果分析

2．7．4 功能菌剂投加对农田土壤微生物功区系及细菌群落结构的影响

2．8 数据处理

3 结果与分析

3．1 腐殖酸对培养液中阿特拉津回收率的影响

3．2 腐殖酸对阿特拉津降解菌生长及降解特性影响

3．2．1 腐殖酸对于阿特拉津降解菌生长影响

3．2．2 腐殖酸对于阿特拉津降解菌降解能力的影响

3．2．3 腐殖酸对于阿特拉津降解菌降解基因表达量的影响

3．3 腐殖酸对于阿特拉津降解菌降解过程转录组学研究

3．3．1 转录组数据结果

3．3．2 功能注释分析

3．3．3 差异基因分析

3．4 基于腐殖酸构建降解微生物菌剂载体材料

3．4．1 载体材料的选择及配比优化

3．4．2 载体材料提升菌体耐受紫外线的能力

3．5 菌制剂盆栽修复污染土壤研究

3．5．1 不同载体菌剂对土壤阿特拉津降解效果

3．5．2 土壤中降解基因表达情况

3．6 菌剂对阿特拉津胁迫条件下玉米幼苗典型生物学特性影响

3．6．1 菌剂对阿特拉津胁迫条件下玉米生长特性的影响

3．6．2 菌剂对阿特拉津胁迫条件下玉米叶绿素的影响

3．6．3 菌剂对阿特拉津胁迫下玉米叶片丙二醛(MDA)含量的影响

3．6．4 菌剂对玉米不同部位阿特拉津积累情况的影响

3．7 玉米农田污染土壤原位修复

3．7．1 生长季菌剂对于田间土壤阿特拉津消减作用

3．7．2 菌剂对于玉米产量的影响

3．7．3 土壤典型养分含量对菌剂的响应

3．7．4 土壤微生物数量对菌剂的响应

3．7．5 土壤微生物群落结构对菌剂的响应

4 讨论

4．1 腐殖酸对于菌株生长降解进程的影响及其机理

4．1．1 腐殖酸对于菌株生长降解进程的影响

4．1．2 腐殖酸影响菌株降解机理初探

4．2 载体材料选择优化

4．3 菌剂对于玉米幼苗期和成熟期生长、生理及品质的影响

4．3．1 菌剂对于玉米幼苗的影响

4．3．2 菌剂不同投加量对于成熟期玉米生理及品质的影响

4．4 菌剂对于土壤微生物数量和结构多样性的影响

4．4．1 菌剂对于土壤微生物数量的影响

4．4．2 菌剂对于土壤微生物多样性的影响

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 本研究的创新点

5．3 展望

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文