二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞体外增殖抑制作用的影响

摘要

犬乳腺肿瘤作为危害母犬健康的常发的肿瘤性疾病之一，其受犬的年龄、品种、绝育状态、繁殖情况以及遗传因素等多种因素的影响。随着犬作为伴侣动物的常态化，犬饲养年限越来越长，犬乳腺肿瘤的发病率在逐年升高，严重威胁犬的健康。犬乳腺肿瘤无论从临床发病特点、组织病理学分型还是乳腺超声、CT诊断上都与人类乳腺癌具有极高的相似性，可以作为人类乳腺癌研究的完美模型。因此，寻求安全而又有效的抗肿瘤药物无论对人类还是犬都是十分必要和迫切的。二甲双胍作为一种口服降糖药，主要用于Ⅱ型糖尿病的治疗，对大量临床案例的统计分析发现二甲双胍在降低糖尿病患者血糖的同时，可以显著降低2型糖尿病患者罹患肿瘤的风险和死亡率，对肿瘤起到一定的预防和治疗作用。本研究以犬转移乳腺肿瘤细胞系CHMm和原发肿瘤细胞系CHMp为模型，进行二甲双胍对犬乳腺肿瘤增殖抑制实验的研究，为二甲双胍用于犬乳腺瘤的研究和治疗提供一定的实验基础和理论依据，主要研究内容及结果如下:
　　1.通过CCK-8法和平板克隆形成实验，检测不同浓度二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞增殖活性和克隆形成能力的影响。结果表明，二甲双胍可显著抑制犬乳腺肿瘤细胞CHMm和CHMp的增殖活性和克隆形成能力，并呈现一定的浓度和时间依赖性，根据对CHMm和CHMp细胞IC50的比较发现:CHMm对二甲双胍的敏感性更高。
　　2.通过Annexin-FITC和PI染色法，检测二甲双胍诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡情况，并通过western blot法检测凋亡关键蛋白的表达。研究证实，随着二甲双胍作用浓度的升高，可诱导犬乳腺肿瘤细胞CHMm发生细胞凋亡，并伴有凋亡核心蛋白caspase-3和PARP的活化切割片段的增加。在CHMp未观察到诱导凋亡的发生，核心蛋白的活化片段量没有发生显著改变。
　　3.通过PI染色和流式细胞仪，检测二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞周期的影响，并通过western blot法检测周期相关蛋白的变化情况。结果发现，二甲双胍可将CHMm和CHMp细胞周期阻滞在G0/G1期，并能上调p21、p27和下调Cyclin D1、CDK4等G0/G1期关键蛋白的表达。
　　4.通过western blot法检测二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞内AMPK/mTOR和PI3K/Akt/mTOR信号通路上关键蛋白的表达，结果发现二甲双胍可显著激活CHMm细胞中的AMPK蛋白，并抑制PI3K、Akt及mTOR的表达。而在CHMp，经二甲双胍处理后，未观察到AMPK的显著性激活，但观察到了PI3K、Akt及mTOR等相关蛋白的抑制现象。
　　结论:本实验验证了二甲双胍对犬乳腺肿瘤的增殖抑制作用，并且此抑制作用可能以激活AMPK和抑制PI3K/Akt/mTOR信号分子为作用靶点通过诱导细胞凋亡和G0/G1期细胞阻滞来实现。这些发现表明二甲双胍有望成为犬乳腺肿瘤的潜在治疗药物，进而为人类乳腺癌的攻克提供一个完美的实验模型和扎实的基础。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 犬乳腺肿瘤

1．1．1 犬乳腺肿瘤的临床发病特点

1．1．2 犬乳腺肿瘤的临床治疗现状

1．2 二甲双胍的概述

1．2．1 二甲双胍的历史

1．2．2 二甲双胍的药代动力学

1．2．3 二甲双胍与血糖调节

1．2．4 二甲双胍的降糖外作用

1．3 二甲双胍的抗肿瘤效应

1．3．1 二甲双胍抗肿瘤的临床依据

1．3．2 二甲双胍抑制肿瘤细胞的基础研究依据

1．3．3 二甲双胍抑制乳腺肿瘤的临床证据和可行性

1．4 二甲双胍抗肿瘤的作用机制

1．4．1 二甲双胍与细胞凋亡

1．4．2 二甲双胍与细胞周期

1．4．3 二甲双胍与AMPK／mTOR信号通路

1．5 本实验的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 细胞系

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要抗体

2．1．4 主要试剂及材料

2．1．5 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 犬乳腺肿瘤细胞的培养和传代

2．2．2 CCK-8法检测犬乳腺肿瘤细胞体外增殖活性

2．2．3 克隆形成实验

2．2．4 流式细胞术检测细胞周期

2．2．5 细胞凋亡检测

2．2．6 二甲双胍处理后细胞相关蛋白表达量的鉴定

2．2．7 数据分析

3 实验结果

3．1 二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞增殖活性的影响

3．2 二甲双胍对犬乳腺细胞克隆形成能力的影响

3．3 二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞凋亡的影响

3．4 二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞周期的影响

3．5 二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞AMPK／mTOR信号通路的影响

3．6 二甲双胍对犬乳腺肿瘤细胞PI3K／Akt信号通路的影响

4 讨论

4．1 二甲双胍抑制犬乳腺肿瘤细胞的增殖

4．2 二甲双胍选择性诱导犬乳腺肿瘤细胞凋亡

4．3 二甲双胍诱导犬乳腺肿瘤细胞发生G0／G1期阻滞

4．4 二甲双胍选择性激活AMPK蛋白

4．5 二甲双胍抑制PI3K／Akt信号通路

4．6 二甲双胍下调犬乳腺肿瘤细胞内mTOR蛋白

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文