大豆尖镰孢根腐病拮抗菌X2生防菌剂的研制与应用

摘要

大豆根腐病是多种土壤习居菌复合侵染引起，分布广、危害重、防治难的世界性大豆土传病害，在中国大豆生产中危害严重。目前，大豆根腐病的防治主要依靠化学防治，而化学药剂带来的环境污染、农药残留和食品安全等问题，且化学药剂持效性差，使得大豆根腐病达不到理想的防效。生物防治对于土传病害具有持效期长、效果好、无残留等优势，逐渐成为可持续农业发展的研究热点。
　　本文以大豆镰孢根腐病主要致病菌尖镰孢为防治对象进行了拮抗菌的筛选，获得1株具有较强抑菌效果的生防细菌(X2)，并进行了鉴定，优化了培养条件和培养基成分、初步进行了抑菌机制和应用的研究。生防细菌X2通过传统与分子鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。利用响应面中心组合设计对X2培养条件进行了优化，最佳培养条件为:温度28.32℃，pH5.77，时间25.78h，接菌量1.06％;利用正交试验L9(34)获得最佳的培养基成分组成为:酵母膏12 g/L、可溶性淀粉10 g/L、碳酸钙5 mg/L。X2的次生代谢产物对尖镰孢的孢子萌发、孢子产生和菌丝生长均有较好的抑制效果。利用硫酸铵饱和沉淀法测定硫酸铵70％饱和度时沉淀蛋白抑菌效果最好，显著高于其它饱和度。将X2制成粉剂进行发酵时间和保存期的测定，培养8d时菌剂活菌数达到最高为1.37×1012 cfu·g-1，常温保存11个月后，仍能保持在3.03×108 cfu·g-1;通过两次盆栽试验，X2粉剂在0.1g/钵的防效在74.6-77.2％之间，与对照化学药剂没有显著差异;在此基础上进行了田间试验，出苗后15d和30 d生防菌X2粉剂(0.08g/株)的防效分别为75.8％和75.4％，与对照药剂处理的防效75.0％和73.9％没有显著差异。盆栽和田间试验的结果表明生防菌X2粉剂对大豆的生长均有很好的防病作用且表观上没有药害发生。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．3 大豆根腐病的病原

1．1．4 大豆根腐病的病害循环及发病因素

1．2 生防菌的研究状况

1．2．1 生防真菌

1．2．2 生防细菌

1．2．3 放线菌

1．3 生防细菌拮抗机理

1．3．1 抗生作用

1．3．2 竞争作用

1．3．3 诱导系统抗性(ISR)

1．3．4 其他机制

1．4 大豆根腐病防治

1．4．1 抗病品种的选育

1．4．2 农业防治

1．4．3 化学防治

1．4．4 生物防治

1．5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 大豆根腐病生防菌的筛选

2．1．1 供试材料

2．1．2 试验方法

2．2 大豆根腐病生防菌的鉴定

2．2．1 供试材料

2．2．2 试验方法

2．3 生防菌株生长曲线的测定

2．3．1 供试材料

2．3．2 试验方法

2．4 生防菌发酵条件和培养基成分的优化

2．4．1 供试材料

2．4．2 试验方法

2．5 X2对尖镰孢抑菌作用的研究

2．5．1 供试材料

2．5．2 试验方法

2．5．3 X2拮抗蛋白的测定

2．6 生防菌X2粉剂的研制

2．6．1 供试材料

2．6．2 试验方法

2．7 生防菌X2粉剂的应用

2．7．1 供试材料

2．7．2 试验方法

3 结果与分析

3．1 大豆根腐尖镰孢的生防菌的筛选

3．1．1 生防菌的筛选结果

3．1．2 抑菌谱的测定

3．2 生防菌X2菌株鉴定

3．2．1 形态学鉴定

3．2．2 X2的生理生化特征

3．2．3 生防菌X2的分子生物学鉴定结果

3．3 生防菌X2生长曲线的分析

3．3．1 生防菌X2的生长曲线

3．3．2 X2发酵液浓度与OD600的相关性

3．4 生防菌X2发酵液培养条件和培养基成分的优化

3．4．1 生防菌X2发酵液培养条件单因素分析

3．4．2 生防菌X2发酵液培养条件多因素结果分析

3．4．3 培养基成分的优化结果

3．5 生防菌X2抑菌作用的分析

3．5．1 生防菌X2发酵液对尖镰孢孢子萌发和孢子产生的影响

3．5．2 生防菌X2发酵液对尖镰孢菌丝生长的影响

3．5．3 生防菌X2发酵液粗提蛋白对尖镰孢菌丝生长的影响

3．6 生防菌X2粉剂的应用研究

3．6．1 发酵时间的确定

3．6．2 保存期的检测

3．6．3 生防菌X2粉剂对大豆根腐病盆栽防效的测定结果

3．6．4 生防菌X2粉剂对大豆根腐病田间防效的测定结果

4 讨论

4．1 生防菌的筛选

4．2 生防菌X2的鉴定

4．3 发酵培养条件的优化

4．4 生防菌X2抑菌作用的研究

4．5 生防菌X2粉剂的研制与应用

4．6 本研究下一步需要开展的工作

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文