贯叶连翘提取物对三氯化铝暴露大鼠海马脑区的保护作用及机制

摘要

铝是一种蓄积性强神经毒物，可通过改变海马脑区氧化应激水平、炎性反应、β样淀粉蛋白(Aβ)表达、树突棘密度导致人或其他模型动物认知功能障碍，且目前尚无有效的治疗手段。贯叶连翘提取物（Hypericum perforatum extract，HP）是一种天然植物药物，具有抗氧化、抗炎症反应、调节Aβ生成和维持树突棘稳定的药理作用。HP对中枢神经系统的保护机制和药理作用均与铝神经毒理机制相拮抗，故推测HP可保护铝暴露大鼠神经系统免受铝毒危害。
　　为探讨HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区的保护作用及机制，本研究选用8周龄雄性Wistar大鼠120只，随机分为空白组（C组）、染铝组(Al组:按150mg/kg的剂量灌胃给予AlCl390d);HP干预组(Al+HP组:按150mg/kg的剂量灌胃给予AlCl390d;给予AlCl330d后，按300mg/kg的剂量灌胃给予HP60d)和HP对照组(HP组:按300mg/kg的剂量灌胃给予HP60d)。给药结束后，通过Morris水迷宫和旷场行为试验，探究HP对AlCl3暴露大鼠认知功能的影响;通过对大鼠体重和脑组织质量的称量及海马铝含量的检测，探究HP对AlCl3暴露大鼠脑体系数的影响;通过检测海马脑区ROS、GSH、MDA、8-OHdG和羰基含量，SOD活性，Nrf2核蛋白和总蛋白表达以及OH-1、GCLC和NQO1 mRNA表达，观测海马脑区超微结构，探究HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区氧化应激和Nrf2信号的影响;通过检测海马脑区MHCⅡ和GFAP蛋白表达，IL-6和TNF-α含量，NF-κB核蛋白和总蛋白表达以及IL-6和TNF-α mRNA表达，探究HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区炎症反应和NF-κB信号的影响;通过检测海马脑区Aβ42含量，淀粉样斑块生成状况以及APP、ADAM9、ADAM10、ADAM17、BACE1、PS1和PS2 mRNA表达，探究HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区Aβ及其相关生成因子影响;通过检测海马脑区树突棘密度、BDNF蛋白表达和F-actin/G-actin蛋白比率，探究HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区树突棘密度及其调节因子的影响。
　　试验结果:
　　(1) Morris水迷宫试验显示，Al组到达平台时间显著高于C组(p＜0.05)，目标象限滞留时间和穿越平台位置次数量显著低于C组(p＜0.01);旷场探索试验显示，Al组穿越方格个数和站立次数均显著低于C组(p＜0.05)，说明AlCl3可导致大鼠认知功能障碍，铝神经毒性损伤大鼠模型建立成功。HP干预后，Morris水迷宫试验显示，Al+HP组到达平台时间显著低于Al组(p＜0.05)，目标象限滞留时间和穿越平台位置次数量显著高于Al组;旷场探索试验显示，Al+HP组穿越方格个数和站立次数均显著高于Al组(p＜0.05)，表明HP可有效缓解AlCl3所致大鼠神经毒性损伤。
　　(2)体重、脑体系数和海马铝含量检测显示，各组间大鼠体重和脑体系数无显著差异(p＞0.05);Al组海马铝含量显著高于C组(p＜0.01)，Al+HP组海马铝含量低于Al组(p＜0.05)，表明HP可降低铝暴露大鼠海马铝含量。
　　(3)氧化应激标志物检测显示，Al组大鼠海马脑区中ROS、羰基、8-OHdG和MDA含量显著高于C组(p＜0.01)，GSH含量和SOD活性显著低于C组(p＜0.01);而Al+HP组ROS、羰基、8-OHdG和MDA含量显著低于Al组(p＜0.05)，GSH含量和SOD活性显著高于Al组(p＜0.05)，表明HP可缓解AlCl3致大鼠海马脑区氧化损伤。
　　透射电镜观察显示，C组海马脑区神经细胞胞质均匀，核膜完整，核质均匀，线粒体数量较多，线粒体膜结构完整，线粒体脊结构清晰;Al组海马脑区神经细胞出现核膜不完整，核质溶解，线粒体膨胀，脊结构模糊不清，甚至出现空泡化现象;Al+HP组和HP与C组相似，无显著病理变化，表明HP可缓解AlCl3致大鼠海马脑区超微结构损伤。
　　Nrf2信号检测显示，Al组和Al+HP组Nrf2核蛋白和总蛋白表达均显著高于C组(p＜0.05)，OH-1 mRNA、GCLC mRNA和NQO1 mRNA表达均显著高于C组(p＜0.05);而Al+HP组Nrf2核蛋白和总蛋白表达均显著高于Al组(p＜0.01)，OH-1 mRNA、GCLC mRNA和NQO1 mRNA表达均显著高于Al组(p＜0.01)，表明HP可激活Nrf2信号缓解AlCl3致海马脑区氧化应激。
　　(4)胶质细胞激活标志物和促炎性因子检测显示，Al组MHCⅡ和GFAP蛋白表达以及IL-6和TNF-α含量均显著高于C组(p＜0.01)，Al+HP组MHCⅡ和GFAP蛋白表达以及IL-6和TNF-α含量均显著低于Al组(p＜0.01)，表明HP可缓解AlCl3致大鼠海马脑区炎性反应。
　　NF-κB信号检测显示，Al组NF-κB核蛋白和总蛋白表达以及IL-6和TNF-α mRNA表达均显著高于C组(p＜0.01)，Al+HP组NF-κB核蛋白和总蛋白表达以及IL-6和TNF-αmRNA表达均低于Al组(p＜0.05)，表明HP可抑制NF-κB信号缓解AlCl3致海马脑区炎症反应
　　(5) Aβ42含量检测显示，Al组海马脑区Aβ42含量显著高于C组(p＜0.01)，而Al+HP组海马脑区Aβ42含量显著高于C组(p＜0.01)。另外，刚果红染色观测显示，Al组海马脑区可见大量红色淀粉样斑块，而HP+Al组红色淀粉样斑块极少，表明HP可缓解AlCl3致大鼠海马脑区Aβ生成增多。
　　APP及其相关水解酶检测显示，Al组海马脑区APP，BACE1，PS1和PS2 mRNA表达显著高于C组(p＜0.01)，ADAM9、ADAM10和ADAM17 mRNA表达显著低于C组(p＜0.01);而Al+HP组海马脑区APP、BACE1、PS1和PS2 mRNA表达低于Al组(p＜0.01)，Al+HP组ADAM9、ADAM10和ADAM17 mRNA表达高于Al组(p＜0.05)，表明HP可抑制APP mRNA表达并改变其水解途径缓解AlCl3致大鼠海马Aβ生成增加。
　　(6)树突棘密度检测显示，Al组DG区、CAl区以及CA3区低于C组(p＜0.05)，Al+HP组DG区、CA1区以及CA3区高于Al组(p＜0.05)，表明HP缓解AlCl3所致的大鼠海马脑区树突棘密度降低。
　　BDNF蛋白表达和F-actin/G-actin蛋白比率检测显示，Al组BDNF蛋白表达和F-actin/G-actin蛋白比率显著低于C组(p＜0.01);而Al+HP组BDNF蛋白表达和F-actin/G-actin蛋白比率高于Al组(p＜0.05)，表明HP通过增加BDNF蛋白表达和F-actin/G-actin蛋白比率以缓解AlCl3所致的大鼠海马脑区树突棘密度降低。
　　上述结果证实，HP可通过缓解AlCl3暴露大鼠海马脑区氧化应激水平、炎性反应、Aβ生成增多和树突棘丢失，保护海马脑区免受铝的神经毒性损伤。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 机体内铝的来源

1．1．1 饮水

1．1．2 食物

1．1．3 医疗

1．1．4 大气

1．2 铝对神经系统影响

1．2．1 铝对神经系统氧化应激及Nrf2信号的影响

1．2．2 铝对神经系统炎症和NF-κB信号的影响

1．2．3 铝对Aβ及其相关生成酶的影响

1．2．4 铝对树突棘可塑性及其相关因子的影响

1．2．5 铝中枢神经系统他方面的影响

1．3 铝神经毒性防治药物的研究

1．3．1 金属螯合物

1．3．2 维生素及微量元素

1．3．3 动物源类生物制品

1．3．4 植物源类生物制品

1．3．5 其他治疗药物及治疗手段

1．4 贯叶连翘提取物的药理作用

1．5 研究意义与目的

1．6 研究技术路线

2 材料与方法

2．1 主要仪器和设备

2．2 主要材料和试剂

2．3 贯叶连翘提取物有效成分的定性分析

2．3．1 贯叶连翘提取物样品溶液制备

2．3．2 标准品溶液制备

2．3．3 高效液相色谱条件

2．4 实验动物及样品采集

2．4．1 实验动物

2．4．2 样品采集及处理

2．5 检测项目与方法

2．5．1 行为学测试

2．5．2 脑体系数测定

2．5．3 海马铝含量检测

2．5．4 海马脑区氧化应激及Nrf2信号相关指标检测

2．5．5 海马脑区炎症反应及NF-κB信号相关指标的检测

2．5．6 海马脑区Aβ及其相关生成酶的检测

2．5．7 海马脑区树突棘密度及其相关因子的检测

2．6 实验数据的分析及统计

3 实验结果

3．1．1 HP对AlCl3暴露大鼠Morris水迷宫实验的影响

3．1．2 HP对AlCl3暴露大鼠旷场实验的影响

3．3 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区氧化应激和Nrf2信号的影响

3．3．1 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区氧化应激标志因子的影响

3．3．2 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区超微结构的影响

3．3．2 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区Nrf2信号的影响

3．4 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区炎症反应和NF-κB信号的影响

3．4．1 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区炎症反应影响

3．4．2 HP对铝暴露大鼠海马脑区NF-κB信号的影响

3．5 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区Aβ及其生成相关因子的影响

3．5．2 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区APP及其裂解酶的影响

3．6 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区树突棘密度及其相关分子的影响

3．6．1 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区树突棘密度的影响

3．6．2 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区BDNF蛋白表达和F-actin／G-actin蛋白比率的影响

4 讨论

4．3 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区氧化应激的影响

4．5 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区炎症的影响

4．7 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区Aβ及其相关生成酶的影响

4．8 HP对AlCl3暴露大鼠海马脑区树突棘密度及相关调剂的影响

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文