水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗性机理研究

摘要

水稻是中国最重要的粮食作物，它的丰产和丰收对中国粮食的增产有着决定性作用。稗草是中国水稻生产中普遍发生和危害严重的杂草之一，严重影响中国的水稻产量。由于中国水稻产区大部分长期连作，单一的除草剂品种连续使用，导致稗草对常用除草剂的抗药性增强，杂草抗药性的发生已经成为制约中国水稻生产的主要因素。二氯喹啉酸是目前水稻田最常用的除草剂，然而由于连续使用，使得稗草对其抗性越来越强。
　　本论文采用生物测定方法研究了不同种群稗草对二氯喹啉酸的抗药性程度，并结合化学分析和分子生物学方法，系统的研究了稗草对二氯喹啉酸的抗性机制。利用化学合成的方法，合成了一系列新型二氯喹啉酸同系物，确定了其生物活性，并通过对不同抗性水稻田稗草的防除效果的研究，为水稻田抗性稗草的合理防除提供理论和实践依据。主要研究结果如下:
　　1、不同种群水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性存在明显差异，其中双鸭山福利、海青、抚远通江等四个地区稗草对二氯喹啉酸最为敏感，抗性指数小于5;齐齐哈尔、桦川、绥棱等四个地区稗草处于低水平抗性阶段，抗性指数5～10;富锦、汤原、延寿等五个地区处于中等抗性水平，抗性指数10～20;而通河、桦南、建三江三个地区稗草达到高水平抗性，抗性指数大于20;不同地区二氯喹啉酸使用的年限不同，稗草的抗性存在明显差异，其中使用二氯喹啉酸四年以下的水稻田的稗草对二氯喹啉酸比较敏感，使用二氯喹啉酸七年以上的水稻田稗草达到中等抗性水平，而抗性水平最高的是使用二氯喹啉酸十年以上的建三江和通河地区的稗草。而且随着使用年限的延长，稗草对二氯喹啉酸的抗性也在逐渐增强。
　　2、不同抗性稗草在二氯喹啉酸胁迫下，植株体内SOD和POD两种保护酶的活性存在明显差异，在二氯喹啉酸胁迫下，稗草体内SOD和POD酶活性会先有短暂的降低，但随后活性会逐渐升高，第五天时达到最高，高抗型稗草种群升高幅度明显大于敏感型稗草种群，随后两种酶活性开始降低，但高抗型稗草种群降低幅度明显低于敏感型稗草种群，说明稗草对二氯喹啉酸的抗性机制与这两种保护酶的活性变化有关，活性越高稗草的抗性越强。
　　3、稗草在二氯喹啉酸胁迫下，植株体内CAT酶活性出现先升高后降低的趋势，第五天达到最高，随后逐渐降低。高抗型稗草种群CAT酶的活性升高幅度明显高于敏感型稗草种群，而下降的速度也明显低于敏感型稗草种群，说明CAT酶活性越强，稗草对二氯喹啉酸的抗性越强。
　　4、稗草植株体内的MDA含量在二氯喹啉酸胁迫下前三天逐渐升高，三天后逐渐降低。抗性稗草MDA含量升高幅度明显低于敏感型稗草，说明MDA含量越低，稗草对二氯喹啉酸的抗性越强。
　　5、稗草植株体内GSH含量和GST酶活性在二氯喹啉酸胁迫下出现先降低后升高的趋势，高抗型稗草GSH含量降低的幅度明显小于敏感型稗草。稗草种群受到二氯喹啉酸的胁迫后，GST活性开始降低，但高抗型的稗草种群GST活性降低幅度明显低于敏感型稗草。说明代谢酶GST的活性是水稻田稗草在植物生化方面对二氯喹啉酸产生抗药性的原因之一，GST酶活性越高，稗草的抗性越强。
　　6、不同抗性稗草在二氯喹啉酸胁迫下，植株体内CAT酶和GST酶的基因表达量存在明显差异。其中，CAT的表达量出现先升高后降低的趋势，第五天时达到最高，高抗型稗草CAT表达量升高幅度明显大于敏感型稗草，说明CAT酶基因表达量越高，稗草的抗性越强。在二氯喹啉酸胁迫下，GST酶表达量出现先降低后升高的趋势，高抗型稗草GST酶表达量变化的幅度明显小于敏感型稗草，说明GST酶的表达量越高，稗草的抗性越强。
　　7、在二氯喹啉酸胁迫下，高抗型稗草和敏感型稗草植株体内的生长素(IAA)和脱落酸(ABA)的含量变化存在明显差异，其中高抗型稗草植株体内的生长素(IAA)含量下降，而敏感型稗草的IAA含量升高。在二氯喹啉酸胁迫下，稗草植株体内脱落酸(ABA)的含量出现先升高后降低的趋势，其中第五天达到最高，高抗型稗草ABA含量升高幅度明显小于敏感型稗草。高抗型稗草两种激素变化比敏感型稗草激素变化相对平稳。
　　8、不同抗性稗草在二氯喹啉酸胁迫下，植株体内的玉米素核苷(ZR)含量和茉莉酸(JA)的含量存在明显差异，其中植株体内的玉米素核苷(ZR)的含量出现先降低后升高的趋势，第五天含量降到最低，高抗型稗草ZR含量下降的幅度明显小于敏感型稗草。在二氯喹啉酸胁迫下，稗草植株体内茉莉酸(JA)的含量出现先升高后降低的趋势，高抗型稗草JA含量升高的幅度明显低于敏感型稗草。
　　9、以二氯喹啉酸作为底物，与甲醇、乙醇和异丙醇在氯化亚砜催化下，进行充分反应，可以得到最高产率为77.2％的3，7-二氯喹啉酸甲酯、最高产率为89.4％的3，7-二氯喹啉酸乙酯和最高产率为64.8％的3，7-二氯喹啉酸异丙酯。三种化合物活性顺序为:二氯喹啉酸异丙酯＞二氯喹啉酸乙酯＞二氯喹啉酸甲酯，二氯喹啉酸异丙酯对抗性稗草的防效明显高于二氯喹啉酸，二氯喹啉酸异丙酯与氰氟草酯复配处理能够对抗性稗草达到很好的防效，株防效和鲜重防效均超过90％。
　　本文的创新点:
　　1.利用分子生物学方法研究了不同抗性稗草的CAT酶和GST酶的基因表达，阐明了不同抗性水平稗草两种酶的表达量存在明显差异，在二氯喹啉酸胁迫下，CAT的表达量先升高后降低，高抗型稗草CAT表达量升高幅度明显大于敏感型稗草。在二氯喹啉酸胁迫下，GST表达量先降低后升高，高抗型稗草GST酶表达量变化的幅度明显小于敏感型稗草。
　　2.通过ELISA方法研究了在二氯喹啉酸胁迫下，稗草植株体内生长素(IAA)、脱落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)和茉莉酸类(JA)的含量变化规律，在二氯喹啉酸胁迫下，高抗型稗草几种激素的变化幅度明显小于敏感型稗草，说明二氯喹啉酸能够通过扰乱激素变化，从而导致稗草的死亡。
　　3.利用化学合成的方法，合成了一系列二氯喹啉酸同系物，并确定了二氯喹啉酸异丙酯的生物活性最高，对抗性稗草的防效明显高于二氯喹啉酸，二氯喹啉酸异丙酯与氰氟草酯复配处理能够对抗性稗草达到很好的防效。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 农田杂草的危害及防除方法

1．2 除草剂的发展与应用现状

1．2．1 除草剂的出现与发展

1．2．2 水田常用的除稗剂

1．2．3 二氯喹啉酸的作用机理及应用现状

1．3 杂草抗药性的研究进展

1．3．1 杂草抗药性的发生和发展

1．3．2 农田杂草的抗药性机理

1．3．3 水稻田稗草对除草剂的抗药性

1．3．4 水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗性机理

1．4 杂草抗药性的检测方法

1．4．1 整株水平测定法

1．4．2 器官或组织水平测定法

1．4．3 细胞或细胞器水平测定法

1．4．4 分子水平检测法

1．5 杂草抗性的分子生物学研究进展

1．6 二氯喹啉酸类化合物的合成及使用情况

1．7 研究的目的意义

1．8 技术路线

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 供试杂草

2．1．2 试验药剂

2．1．3 施药器械

2．1．4 试验试剂

2．1．5 试验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 不同地区水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性差异

2．2．2 水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性机理

2．2．3 实时荧光定量PCR检测相关代谢酶基因表达量

2．2．4 酶联免疫吸附法测定稗草几种植物激素

2．2．5 新型二氯喹啉酸类化合物的合成方法

2．2．6 新型二氯喹啉酸类化合物可湿性粉剂的制备

2．2．7 新型二氯喹啉酸类化合物活性的测定

2．2．8 抗性稗草防除方法

2．2．9 数据处理方法

3 结果与分析

3．1 不同地区水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性差异

3．1．1 种子萌发期水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性差异

3．1．2 整株法测定水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性差异

3．1．3 等浓度效果比较法测定水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗药性差异

3．2 水稻田稗草对二氯喹啉酸的抗性机制

3．2．1 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草光合速率的影响

3．2．2 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草气孔导度的影响

3．2．3 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草叶绿素含量的影响

3．2．4 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草SOD活性的影响

3．2．5 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草POD活性的影响

3．2．6 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草CAT活性的影响

3．2．7 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草GSH含量的影响

3．2．8 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草GST活性的影响

3．2．9 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草MDA含量的影响

3．3 实时荧光定量PCR检测代谢相关酶的表达

3．3．1 RNA提取

3．3．2 RNA浓度测定

3．3．4 二氯喹啉酸对不同抗性水平水稻田稗草GST基因相对表达量的影响

3．4 二氯喹啉酸对稗草几种植物激素含量的影响

3．4．1 二氯喹啉酸对不同抗性水平稗草生长素(IAA)含量的影响

3．4．2 二氯喹啉酸对不同抗性水平稗草脱落酸(ABA)含量的影响

3．4．3 二氯喹啉酸对不同抗性水平稗草玉米素核苷(ZR)含量的影响

3．4．4 二氯喹啉酸对不同抗性水平稗草茉莉酸(JA)含量的影响

3．5 新型二氯喹啉酸类化合物的合成及其制剂的制备

3．5．2 3,7-二氯喹啉酸乙酯化合物的图谱分析

3．5．3 3,7-二氯喹啉酸异丙酯化合物的图谱分析

3．5．4 新型化合物可湿性粉剂的制备

3．6 新型二氯喹啉酸类化合物活性的测定

3．7 不同抗性水平稗草的防治方法

3．7．1 二氯喹啉酸异丙酯和几种除草剂对水稻田稗草的防除效果

3．7．2 针对不同抗性水平稗草的除草剂配方筛选

4 讨论

4．1 不同地区稗草的抗性差异和产生的原因

4．2 水稻田稗草对二氯喹啉酸产生抗性的机制

4．3 新型二氯喹啉酸类化合物的合成及生物活性测定

4．4 水稻田稗草的防除方法

5 结论

致谢

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文