适配体缓解FBl诱导的小鼠细胞凋亡和氧化损伤的机制研究

摘要

伏马毒素B1(Fumonisin B1，FB1)多产自串珠镰刀菌等真菌，是一种污染广泛的霉菌毒素。FB1对多种动物具有毒性作用，如猪肺水肿、马脑白质软化，不仅危害动物健康，而且造成巨大经济损失。目前还未见体内有效清除FB1的方法。为了寻找可以快速高效清除或吸附FB1的物质并探究其体内体外的保护作用，本试验中利用链霉亲和素磁珠与生物素探针的亲和作用，采用非固定靶标的SELEX筛选策略获得了适配体F102。采用ELISA试验测定其亲和力为42.0±13.7 nmol/L，特异性良好，与玉米赤霉烯酮、T-2毒素和黄曲霉毒素B1的交叉反应较低。利用分子模拟方法推测适配体和FB1的结合机制，结果发现FB1的羰基“O”原子与适配体F102的A-8，A-39，A-40和A-42主要是氢键作用。 原代培养小鼠肾细胞，不同浓度FB1（终浓度为0-20，000 ng/mL）处理小鼠肾细胞24 h后确定FB1的损伤浓度为2，500 ng/mL。不同浓度适配体（终浓度为0-100μmol/L）处理小鼠肾细胞24 h后确定适配体的安全保护剂量为1μmol/L。适配体F102和F39分别与FB1共同处理小鼠肾细胞24 h后，结果显示FB1处理组的细胞多有萎缩甚至死亡，具有统计学差异（P＜0.05）;活性氧(Reactive oxygen species，ROS)含量显著增加（P＜0.05）;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)酶活力显著下降（P＜0.05）;抑凋亡基因Bcl-2表达显著降低（P＜0.05），促凋亡基因Caspase3和Caspase9表达显著增加(P＜0.05)。与FB1处理组相比，适配体F102和F39能显著改善上述指标的变化，且F102作用优于F39(P＜0.05)。 将小鼠分为5组，正常对照组，溶剂对照组，FB1处理组，F102处理组，F39处理组，皮下注射，各处理组分别于24 h、48 h采样。结果证明与FB1处理组相比，适配体处理小鼠24 h和48 h后，FB1残留量显著降低（P＜0.05）;肝肾组织变性坏死明显减少;脏器指数无明显差异（P＞0.05）;血液尿素氮显著升高（P＜0.05），谷草转氨酶显著降低（P＜0.05），总胆固醇在处理48 h时显著升高（P＜0.05），谷丙转氨酶在处理24 h显著降低（P＜0.05）;SOD酶和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)酶活力显著增加（P＜0.05），随时间延长酶活力下降但仍显著增加（P＜0.05）;丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量显著降低（P＜0.05），随时间延长组织内MDA含量增加但仍显著降低（P＜0.05）;促凋亡基因Caspase3和Caspase9表达水平显著降低(P＜0.05)，抑凋亡基因Bcl-2表达水平显著升高（P＜0.05），呈时间依赖性，且F102的处理效果优于F39。 综合以上结果，本研究通过SELEX筛选获得了FB1特异性适配体，并验证其可以缓解FB1对小鼠的损伤作用，且其可能与直接清除ROS，提高SOD和GSH-Px酶抗氧化能力，提高抑凋亡基因Bcl-2表达，降低促凋亡基因Caspase3和Caspase9表达水平有关。这为适配体体内应用提供依据，为霉菌毒素吸附剂的研发提供思路，为实验动物的有效防控提供理论基础。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1．3 霉菌毒素的检测技术

1．1．4 霉菌毒素的防控

1．2．2 FB1的污染状况

1．2．4 FB1的检测和清除方法

1．3 适配体概述

1．3．1 适配体的的性质及特点

1．3．2 SELEX技术

1．3．3 适配体的应用发展

1．4 分子模拟简介

1．4．1 分子模拟技术

1．4．2 分子模拟的方法

1．4．3 分子模拟的应用

1．5 本研究的目的与意义

2 材料

2．1 毒素及磁珠

2．2 实验动物

2．3 引物及分子模拟软件

2．3．1 分子模拟软件

2．3．2 引物

2．4 酶及生化试剂

2．5 主要仪器和设备

3 方法

3．1．3 PCR扩增

3．1．4 扩增文库的回收与纯化

3．1．5 亲和力和特异性的测定

3．2 适配体体外缓解FB1诱导小鼠肾细胞损伤机制

3．2．1 小鼠肾细胞的培养

3．2．4 适配体对FB1诱导肾细胞损伤的保护

3．3 适配体体内缓解FB1诱导小鼠组织损伤机制

3．3．1 动物感染试验

3．3．2 小鼠脏器指数的测定

3．3．3 FB1组织残留量的测定

3．3．4 血液生化指标的测定

3．3．5 肾组织氧化指标的测定

3．3．6 肾组织细胞凋亡情况的测定

3．3．7 统计学处理

4 结果与分析

4．1．2 筛选过程的监控

4．1．3 同源序列的富集比对

4．1．4 亲和力及特异性的测定

4．1．5 特异性适配体的结构预测

4．1．6 适配体与FB1的结合机制

4．2 适配体缓解FB1诱导小鼠肾细胞损伤的毒性研究

4．2．1 FB1损伤浓度的确定

4．2．2 适配体安全剂量的选择

4．2．3 适配体对FB1诱导肾细胞损伤的保护

4．3 适配体缓解FB1诱导肾组织损伤的毒性研究

4．3．2 适配体对FB1损伤小鼠肾组织病理变化的影响

4．3．3 适配体对FB1损伤小鼠肾组织脏器指数的影响

4．3．4 适配体对FB1损伤小鼠血液生化指标的影响

4．3．5 适配体对FB1损伤小鼠肾组织氧化指标的影响

4．3．6 适配体对FB1损伤肾组织细胞凋亡情况的影响

5 讨论

5．1 适配体筛选方法的选择

5．2 适配体筛选的富集过程

5．3 适配体亲和力的比较

5．5 适配体缓解FB1损伤的病理变化

5．7 适配体缓解FB1氧化损伤的机制

5．8 适配体缓解FB1诱导凋亡的机制

6 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文