黄瓜CsDREB1的克隆及霜霉威胁迫下的功能分析

摘要

黄瓜（Cucumis sativus L.）口感爽脆、用途广泛，是一类以温室栽培为主的蔬菜，生长状况易受环境及土壤影响，霜霉病为黄瓜主要的易感病害之一。霜霉威(Propamocarb)为一类内吸型杀菌剂，具有低毒性、半衰期短等特点，防治霜霉病效果良好。然而喷施霜霉威容易引起黄瓜体内霜霉威残留过高，引发新的食品安全问题。因此，黄瓜低农残的相关研究对提升黄瓜的品质和食用安全性意义重大。 课题组前期通过对低农药残留品系‘D0351’进行转录组的测序，筛选得到了一个霜霉威胁迫下表达量明显下降的CsDREB1。推测CsDREB1为调控黄瓜农残的重要转录因子，通过调控其他基因发挥作用。本文通过克隆、表达模式分析、亚细胞定位等分子生物学。研究成果如下: (1)通过PCR技术成功克隆出CsDREB1的CDS序列，长度是603bp，编码200个氨基酸，包含一段63个氨基酸组成的AP2结构域，是AP2超级家族成员之一。 (2)通过生物信息学方法预测该基因理论分子量22.26KD，属于不稳定亲水蛋白，无明显信号肽，无明显跨膜区域。黄瓜CsDREB1与甜瓜CmDREB1D之间的亲缘关系近，CsDREB1属于DREB-A1亚组。 (3)通过qPCR对CsDREB1在不同品种、不同时间不同组织中表达模式进行分析。研究发现，在霜霉威胁迫下，CsDREB1在农残品系‘D0351’的表达量低于高农残品系‘D9320’;与对照组相比，霜霉威胁迫下‘D0351’中CsDREB1的表达量明显下降，‘D9320’中CsDREB1的表达量无明显变化;对CsDREB1在不同时间下的的表达模式进行了分析，未发现时间特异性;对CsDREB1在不同部位中的表达模式进行了分析，发现CsDREB1主要的差异表达部位是果实。 (4)向拟南芥原生质体中导入CsDREB1与绿色荧光蛋白(GFP)融合产物，通过激光共聚焦显微镜观察发现，CsDREB1编码的蛋白定位在细胞核上，是核蛋白，CsDREB1主要在细胞核中发挥转录因子功能。 (5)构建pBI121-CsDREB1植物过表达载体，通过花序侵染法将CsDREB1导入到野生型拟南芥中。对野生型拟南芥和转基因拟南芥分别进行霜霉威胁迫（浓度为2mmol L-1霜霉威的MS培养基）。观察发现，对照组中，转基因拟南芥和野生型拟南芥的萌发率和根长无明显变化;在霜霉威胁迫下，转基因拟南芥的萌发率和根长明显低于野生型拟南芥。说明CsDREB1可以响应霜霉威的胁迫，CsDREB1过表达拟南芥植株对霜霉威的耐性明显降低。 (6)通过分析其他胁迫下CsDREB1的表达模式，发现在脱落酸、高盐、干旱和多主棒孢霉菌处理下的CsDREB1的表达量明显降低，在茉莉酸处理下CsDREB1的表达量明显升高。 (7)通过农杆菌介导法将CsDREB1导入黄瓜高农残品系‘D9320’中，经PCR确认获得11株CsDREB1转基因植株，收获其F1代黄瓜种子。

目录

声明

摘要

1．前言

1．1 研究目的及意义

1．2 研究内容及研究路线

1．2．1 主要研究内容

1．2．2 试验的技术路线图

1．3 国内外研究进展

1．3．1 蔬菜农药残留

1．3．2 霜霉威研究现状

1．4 AP2转录家族研究现状

1．4．1 AP2大家族的基本信息

1．4．2 DREB转录因子亚族

1．4．3 DREB抗逆性研究现状

2．材料与方法

2．1 试验种质材料

2．2 试验试剂及菌株

2．3．1 黄瓜果实RNA的提取和检测

2．3．2 合成cDNA的第一条链

2．3．4 将CsDREB1的PCR扩增产物进行回收

2．3．5 与pEASY-T3载体的连接及阳性克隆筛选

2．5 CsDREB1的表达模式分析

2．6 CsDREB1亚细胞定位分析

2．6．1 构建植物绿色荧光表达载体

2．6．2 纯化质粒

2．6．3 制备拟南芥原生质体细胞

2．7 CsDREB1对拟南芥的遗传转化

2．8 获得CsDREB1转基因拟南芥植株

2．8．2 获得CsDREB1转基因拟南芥纯合株系

2．8．3 分子鉴定转基因拟南芥

2．8．4 转基因拟南芥霜霉威下功能分析

2．9．2 转基因实验方法

2．9．3 侵染外植体

2．9．4 共培养并筛选培养外植体

2．9．5 分化芽的生根培养及转基因植株的驯I化

2．9．6 确认转基因黄瓜植株并收集黄瓜种子

3．结果与分析

3．2 CsDREB1的生物信息学分析

3．2．2 CsDREB1的系统进化树分析

3．2．3 分析CsDREB1的启动子区域顺式元件

3．3 CsDREB1的表达模式分析

3．3．2 CsDREB1在霜霉威胁迫下不同时间的表达分析

3．3．3 CsDREB1不同器官中的表达分析

3．4 CsDREB1编码蛋白的亚细胞定位

3．5 CsDREB1转基因拟南芥植株的功能分析

3．5．2 植物过量表达载体35S-CsDREB1的根癌农杆菌转化

3．5．3 T0代转基因拟南芥植株的筛选

3．5．5 过表达CsDREB1拟南芥的功能分析

3．6 其他逆境胁迫下CsDREB1的表达分析

3．7 黄瓜遗传转化

3．7．1 获得CsDREB1转基因黄瓜植株

3．7．2 鉴定抗性黄瓜植株

4．讨论

4．4 过表达CsDREB1拟南芥植株的抗性分析

4．7 本研究的创新和不足之处

4．7．1 本研究的创新之处

4．7．2 本研究的不足之处

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文