基于SNP--CAPS标记的甜瓜遗传连锁图谱构建及果实相关性状QTL分析

摘要

甜瓜（Cucumis melo L.，2n=2x=24）是葫芦科作物中营养丰富且具有极高经济价值的水果型蔬菜作物，其果实具有丰富多样的表型性状和生理特征。甜瓜果实性状对消费者和市场销售商的选择有重要影响。各种基因调控着甜瓜的果实品质性状，而这些基因又被很多不同的因素调控。快速发展的高通量重测序技术已经使大量的作物基因组重测序成为可能，同时也促进了开发新的分子标记。近年来，用CAPS分子标记开展QTL分析已成为一种十分重要的方法。 本研究通过建立新的基于SNP-CAPS分子标记，构建遗传连锁图谱，进行QTL分析，对甜瓜果实性状的遗传机制进行了研究。本研究选用MR-1作为母本(P1)，M4-7作为父本(P2)，构建F2∶3群体。两个表型差异显著的亲本通过重测序后，分析两个亲本基因组之间的SNP位点，并将这些SNP位点转化成CAPS分子标记。分别将母本91.54％的基因组测序数据和父本90％基因组测序数据比对到甜瓜参考基因组上。在双亲基因组之间共开发出了2，761，801个SNP，并转化成了7，741个CAPS标记。用4种限制性内切酶转化了410个CAPS标记。通过PCR扩增和酶切反应，筛选出160个在两个亲本材料及其F1中具有多态性的CAPS标记，多态性率为39％。本研究用分布在12条染色体上的160个CAPS分子标记构建了遗传连锁图谱，该遗传图谱全长为2848.68 cM，平均遗传距离为17.80 cM。在整个构建的遗传连锁图谱中，3号染色体的CAPS标记最少，仅有7个，9号染色体的最多，有20个，所有CAPS标记在遗传连锁图上的位置与其在物理图谱中的位置一致。 各种果实相关性状，如果实重量、果实形状、果实长度、果实宽度、果实硬度、果肉硬度、可溶性固形物、pH值和可滴定酸度(TA)等性状在F2∶3群体中均呈正态分布，表明所有性状均是数量性状，且它们之间显著相关。结果表明，49个不同位点的QTLs与9个甜瓜果实性状关联，它们分布在不同的染色体上，它们的LOD值的范围在2.53～52.77之间，表型变异贡献率在1.02～12.98％。而在整个基因组区域没有发现与果实长度相关的QTL。与果实宽度连锁的6个QTL(qFwid)和与果型连锁的4个QTL(qFSh)分布在三条不同染色体（5，8和9）上，对果实宽度变异的贡献率为15.23％，对果型性状变异的贡献率为20.01％。4个与果实重量连锁的QTL(qFWt)在三条不同的染色体(25和10)上，总贡献率为26.57％。在4条不同的染色体（2，3，5和8）上发现了5个QTL(qFFir)与果实硬度连锁，总贡献率为27.84％。2个与果肉硬度连锁的QTL(qFlFir)被精确定位在3和6号染色体，贡献率为15.94％。1个果实硬度的QTL(qFFir-3-1)与一个果肉硬度QTL(qFlFir-3-1)重叠在同一个22 cM遗传区域，而它们之间的遗传间隔是0 cM，为同一遗传点。3个与可溶性固形物连锁的QTL（qBrix）分布在3条不同的染色体(7，9和10)上，表型性状贡献方差为5.32％。与pH连锁的12个QTLs(qpH)分布在9条不同的染色体(1，2，4，5，6，7，8，9和10)上，总贡献率为38.37％。与可滴定酸度连锁的13个QTL(qTA)位于9条不同的染色体上(2，5，6，7，8，9，10，11和12)，总贡献率为11.76％。在6号染色体上qpH-6-1与qTA-6-1上，其遗传位置重叠，两个侧翼标记之间的遗传距离为0 cM。 总之，目前的研究结果验证了全基因组重测序极大地提高了分子标记开发、连锁图谱构建以及QTL定位的能力。本试验所构建的遗传连锁图谱基于SNP-CAPS标记。此外，我定位到了与9个甜瓜品质性状相关的49个QTLs，为今后的MAS育种提供了参考。

目录

声明

摘要

Abstract

1 Introduction

1．1 Fruits

1．2 Melon introduction and its classification

1．3 Melon botany and its origin

1．4 Physiological changes occur during ripening in melon

1．5 Biochemical changes occur during ripening in melon

1．5．1 Carbohydrate metabolism

1．5．2 Organic acids

1．5．3 Cell wall metabolism

1．6 Moleeular markers

1．6．1 Categories of molecular markers

1．6．2 Dominant DNA markers

1．6．3 Co-dominant markers

1．7 Sequencing technology

1．7．2 Application of High-throughput sequencing

1．8 Quantitative trait loci(QTL)

1．8．1 Mapping population

1．8．2 Linkage map analysis

1．8．3 Determination of genetic distance

1．8．4 Statistical methods to detect QTL

1．9 Various genetic basis studies for QTL detection in melon and other fruits

1．10 Objectives of current research

1．11 Technical route of research

1．12 Annual research plan

2 Materials and methods

2．1 Field trials and methods

2．1．1 Experimental material

2．1．2 Greenhouse test design

2．1．3 Seed treatment

2．1．4 Raising of nursery seedlings

2．1．5 Selfing of F2：3 plant population

2．1．6 Phenotypic evaluation for fruit traits

2．2 Molecular experiment reagents and instruments

2．2．1 Required reagents

2．2．2 Molecular experiment instruments

2．2．3 Preparation of required reagents

2．3 Molecular experiment procedures

2．3．1 Sequencing library assembling

2．3．2 Assembling of CAPS markers by High-throughput sequencing information

2．3．3 CAPS markers designing

2．3．4 PCR for CAPS markers verification and genotyping

2．3．5 Restriction endonuclease (RE) digestion reaction

2．4 Molecular markers data analysis method

2．4．1 CAPS markers genotyping data analysis，procedure and method

2．4．2 Genetic map assembling and QTL analysis

2．4．3 Statistical analysis

3 Results and analysis

3．2 Analysis of CAPS polymorphism screening and DNA detection

3．3 Analysis of linkage map construction through novel CAPSs

3．4 Analysis of melon fruit traits

3．4．1 Analysis of fruit weight

3．4．2 Analysis of fruit firmness

3．4．3 Analysis of fruit length and width

3．4．4 Analysis of fruit shape

3．4．5 Analysis of flesh firmness

3．4．6 Analysis of Brix

3．4．7 Analysis of pH

3．4．8 Analysis of TA(titratable acidity)

3．5 Analysis of QTLs related to fruit traits

3．5．1 Analysis of fruit weight QTLs

3．5．2 Analysis of fruit firmness QTLs

3．5．3 Analysis of flesh firmness QTLs

3．5．4 Analysis of Brix QTLs

3．5．5 Analysis of fruit length，width and shape QTLs

3．5．6 Analysis of pH QTLs

3．5．7 Analysis of TA (titratable acidity) QTLs

4 Discussion

4．1 Importance of molecular markers

4．2 Linkage map assembling by CAPS markers

4．3 Detection of melon fruit traits QTLs

4．3．1 Fruit weight QTLs

4．3．2 Fruit length，width and shape QTLs

4．3．3 Fruit firmness and flesh firmness QTLs

4．3．4 Fruit Brix QTLs

4．3．5 Fruit pH and TA QTLs

4．4 Innovative points

5 Conclusion

5．1 Fruit traits segregation

5．3 Linkage mapping and QTL analysis

Acknowledgement

References

Appendix

Papers published during the time period of Ph．D education