人胚胎干细胞悬浮培养体系建立

摘要

人胚胎干细胞(human Embryonic Stem Cells，hESCs)是一类具有多向分化能力及体外增殖能力的干细胞，因而hESC拥有巨大的临床应用前景。随着干细胞相关研究的快速发展，干细胞的临床转化治疗已在再生医学领域占据了举足轻重的地位。尤其是在许多常规手段无法解决的重大科学问题中，如脊髓损伤、癌症、年龄相关性视网膜变性等疾病，干细胞治疗取得了令人鼓舞的效果。 随着干细胞研究的深入与拓展，常规的二维细胞培养方式已远远不能满足现有的研究和临床转化需求。自然界中的细胞生存在三维的体内环境中，而二维培养会束缚干细胞的生长与分化，因而干细胞分化获得的功能细胞中，均存在着功能不健全的问题，如分化获得的肝细胞酶表达水平，不如体内获得的原代肝细胞。因此，利用三维培养模式模拟体内细胞生长环境，进行细胞的体外培养和分化已成为当今主流趋势。除此之外，移植一位患者，往往需要109数量级的细胞。常规的干细胞制备手段，需要消耗大量的人力物力，这不仅将增加干细胞治疗的成本，而且在制备过程中增加了污染风险，干细胞制品批次间的稳定性也会因技术人员技术水平的差异而变得不稳定。3D培养方式已在成熟细胞系有所尝试，并用于规模化的蛋白或其他活性成分的制备。因此，为了推进干细胞的实际应用，开发适用于干细胞规模化制备的3D悬浮培养方法，已成为干细胞基础和临床转化研究中的重要方向。 我们在本研究中利用超低贴附培养皿摸索适用于hESC悬浮培养的培养时程、培养基种类、细胞密度、传代方式等培养条件。我们利用细胞计数，细胞活性检测，荧光定量PCR，流式细胞术、免疫荧光染色等技术检测细胞在上述不同培养条件下的生存状况，最终得到适用于规模化培养人胚胎干细胞的条件与参数。在稳定的体系下，我们扩大了人胚胎干细胞的培养规模，逐步使用更大体积的细胞培养袋进行培养，最后在1.8L的培养袋中实现1.5L的人胚胎干细胞的稳定培养。通过显微镜观察，免疫荧光染色，荧光定量PCR，流式细胞术，核型分析，拟胚体形成，畸胎瘤注射、体外分化等技术完成了对规模化培养人胚胎干细胞的各种水平的鉴定。 研究结论如下:通过对人胚胎干细胞规模化扩增系统的摸索，在技术方法上建立了规模化、标准化人干细胞悬浮培养体系，通过该体系实现了单个1.5L体系可扩增1.5×109个细胞的目标，更重要的是悬浮培养的细胞可以在体外连续传代30代以上。在此系统下，细胞球大小均一，且细胞活率高，人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、SOX2、NANOG等阳性率均大于90％。通过畸胎瘤检测表明悬浮培养的hESCs依然保持三胚层分化能力。此外，我们进一步优化系统，悬浮培养的hESCs能够在体外分化成间充质干细胞(hES-MSC)。流式细胞术检测结果表明这些细胞表达MSCs特异性标志物，且可以定向诱导分化成骨细胞、脂肪细胞以及软骨细胞。综上所述，我们建立的干细胞悬浮培养体系能够进行高质量的和规模化的人胚胎干细胞扩增，并且这些细胞能够在体外分化为功能细胞，这为将来进一步的更大规模的干细胞扩增提供了基础，也为干细胞临床应用过程中功能细胞来源不足问题提供了解决方案。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 人胚胎干细胞分离及培养研究进展

1．1．1 多能干细胞的分类及定义

1．1．2 人胚胎干细胞分离的研究历史

1．1．3 人胚胎干细胞培养体系的发展

1．2 干细胞临床应用的发展

1．3 干细胞规模化培养的发展

1．4 研究的目的和意义

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验试剂

2．1．2 实验耗材

2．1．3 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 人胚胎干细胞2D复苏、培养和传代

2．2．2 hESCs的悬浮培养、传代、冻存和复苏

2．2．3 hESCs在细胞培养袋中的培养、传代、冻存和复苏

2．2．4 悬浮培养的hESCs的鉴定

3 结果与分析

3．1 建立hESCs在超低贴附培养皿中的悬浮培养体系

3．2 hESCs悬浮培养体系的建立

3．3 大规模悬浮培养的hESCs的鉴定

4 讨论

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文