转Lea基因小黑杨花粉植株抗旱、耐盐性分析

摘要

本研究利用农杆菌介导法将从极度抗旱、耐盐植物柽柳中克隆得到的lea基因(late embryogenesis abundant，)导入小黑杨花粉植株基因组中，通过对转基因小黑杨和非转基因对照小黑杨的盐、旱胁迫试验，比较它们抗性的强弱，筛选出抗性优良的转基因株系。 对小黑杨花粉植株进行遗传转化，共获得11株卡那霉素抗性芽，对其进行PCR检测，结果均为阳性；进行PCR-Southem杂交，各转基因株系均出现杂交谱带，证明lea基因已整合到小黑杨花粉植株基因组中；进一步对11个株系进行Northem杂交和实时荧光定量RT-PCR检测，结果表明外源基因在RNA水平上得到表达。 分别对11个转基因株系进行了NaCl胁迫和干旱胁迫试验，分析逆境胁迫条件下转基因小黑杨与非转基因对照小黑杨的丙二醛(MDA)含量、相对电导率、过氧化物酶(POD)活性、叶绿素含量、净光合速率等指标的变化，结果表明，在200 mmol．L<'-1>NaCl处理6 d后，各转基因株系POD活性与对照之间无明显规律；平均：MDA含量和质膜相对透性分别低于对照植株的14.4％和14.5％；平均净光合速率和叶绿素含量分别高于对照植株的140％和15.8％，综合耐盐性分析表明：耐盐性从强到弱分别为T11>T1> T14>T6>T3>T10>T5>T13>T4>T9>T7>CK。综上说明，盐胁迫条件下，转基因小黑杨受害程度明显小于对照，抗盐能力强于对照。 干旱胁迫处理7 d后，转基因小黑杨相对电导率平均低于对照小黑杨11.41％；平均MDA含量低于对照小黑杨17.71％；而此时POD活性与对照之间仍无明显规律；而转基因小黑杨的叶绿素平均含量为47.43 mg．g<'-1>，高于对照的14.57％，平均净光合速率高于对照植株的31.5％，综合抗旱性分析表明：抗旱性从强到弱分别为T11>T9 >T14>T1>T13>T7>T10>T3>T6>T4>T5>CK。说明lea基因的导入提高了小黑杨的抗旱能力。 综合以上结果，lea基因的表达能够不同程度提高转基因小黑杨的抗干旱、耐盐碱胁迫能力，其中T11抗性最强，T1、T14次之，其余各转基因株系的抗性也明显高于非转基因对照。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1引言

1.2干旱、盐碱胁迫对植物的影响

1.2.1干旱胁迫对植物的影响

1.2.2盐胁迫对植物的影响

1.3杨树抗旱、耐盐碱基因工程研究概况

1.4抗旱、耐盐碱相关基因

1.4.1 lea基因研究进展

1.5本项研究的目的意义

2 lea基因对小黑杨的遗传转化及分子检测

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2培养基

2.1.3实验仪器

2.2lea基因的遗传转化

2.2.1材料的准备

2.2.2根癌农杆菌介导的小黑杨花粉植株的遗传转化

2.3转lea基因小黑杨的分子检测

2.3.1主要试剂

2.3.2实验方法

2.3.3 PCR-Southern杂交过程

2.3.4 Northern印记杂交过程

2.3.5实时荧光定量RT-PCR检测

2.4结果与分析

2.4.1 lea基因的高效遗传转化体系的建立

2.4.2转化小黑杨的PCR检测

2.4.3转化小黑杨的PCR-Southern杂交

2.4.4转化小黑杨的Northern印迹杂交

2.4.5实时荧光定量RT-PCR检测

3转基因小黑杨的耐盐性分析

3.1实验材料

3.1.1植物材料

3.1.2试剂

3.1.3仪器设备

3.2实验方法

3.2.1材料

3.2.2超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

3.2.3过氧化物酶(POD)活性测定

3.2.4丙二醛(MDA)含量测定

3.2.5相对电导率测定

3.2.6光合生理指标测定

3.2.7隶属函数法综合评定耐盐性

3.3结果与分析

3.3.1 NaCl胁迫下转lea基因小黑杨及对照质膜相对透性比较

3.3.2 NaCl胁迫下转lea基因小黑杨及对照丙二醛含量比较

3.3.3 NaCl胁迫下转lea基因小黑杨及对照POD活性比较

3.3.4 NaCl胁迫下转lea基因小黑杨及对照净光合速率比较

3.3.5转lea基因小黑杨NaCl胁迫下叶绿素含量比较

3.3.6耐盐生理指标综合分析

4转基因小黑杨的抗旱性分析

4.1实验材料

4.1.1植物材料

4.1.2试剂

4.1.3仪器设备

4.2实验方法

4.2.1材料

4.2.2实验方法

4.3结果与分析

4.3.1干旱胁迫下转lea基因小黑杨及对照质膜相对透性比较

4.3.2转lea基因小黑杨干旱胁迫下丙二醛含量比较

4.3.3干旱胁迫下转lea基因小黑杨及对照POD活性比较

4.3.4干旱胁迫下转lea基因小黑杨及对照净光合速率比较

4.3.5干旱胁迫下转lea基因小黑杨及对照叶绿素含量比较

4.3.6抗旱生理指标综合分析

5讨论

5.1 lea基因提高小黑杨的耐盐能力

5.2 lea基因提高小黑杨的抗旱能力

6结论

参考文献

附录

图版

攻读学位期间发表的学术论文

致谢