烟草叶片愈伤组织诱导过程中细胞程序性死亡发生的分子基础

摘要

本文以烟草叶片在MS培养基上诱导愈伤组织过程中，十个不同时期的愈伤组织叶片为材料，通过Hoechst 33258荧光染料染色显微观察结果表明：细胞核在形态上发生了典型的细胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)特征——缩缢变形；通过CTAB法提取愈伤组织诱导叶片总DNA进行TBE琼脂糖电泳检测，出现了标志着PCD发生的DNA片段化的梯状图谱，即DNA ladder，这些结果均表明了在烟草叶片愈伤组织诱导过程中发生了细胞程序性死亡，而在诱导的第6个时期，即诱导的第13天DNA的片段化现象最为明显，表明这一时期是PCD发生较为活跃的时期。 通过酶联免疫法测定诱导前14天愈伤组织叶片中内源激素ABA的含量，在诱导的第5时期开始出现大量的ABA，而在诱导的第6时期，即诱导的第13天ABA含量相对达到了峰值，这一结果表明，ABA在愈伤组织的诱导过程中，对PCD的发生起到了调节作用。 用RT-PCR法在诱导的前9个时期，即诱导的第3、5、7、9、11、13、15、17、19天的叶片的愈伤组织中均扩增出了细胞程序性死亡相关基因Beclin-l的cDNA片段(678bp)，经过克隆测序表明，与烟草叶片(AY-701316)中Beclin-l基因的同源性为95％：进一步的以RNA为探针，Northen杂交结果显示，在诱导的第6时期，即诱导的第13天，杂交信号最为强烈，即Beclin-l基因表达最为强烈。 综合以上结论：在烟草叶片愈伤组织诱导过程中伴随PCD的发生，在此过程中内源激素ABA与Beclin-l基因对细胞程序性死亡起到了调节作用。

目录

文摘

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声明

1绪论

1.1烟草简介

1.2细胞程序性死亡概述

1.2.1细胞坏死、凋亡和程序性死亡

1.2.2植物PCD的功能

1.2.3植物PCD的特征

1.2.4细胞程序性死亡的检测技术

1.2.5植物PCD的诱导因子

1.3植物PCD的相关基因

1.4 Beclin-1基因与细胞程序性死亡

1.5课题的研究目的和意义

2烟草叶片愈伤组织诱导过程中PCD的检测

2.1实验材料

2.2实验方法

2.2.1细胞核的形态学观察

2.2.2 DNA的提取

2.2.3 DNA ladder电泳检测

2.3结果与分析

2.3.1细胞核的形态学观察结果及分析

2.3.2 DNA的提取结果及分析

2.4本章小结

3烟草愈伤组织诱导过程中ABA含量的测定

3.1实验材料

3.2实验方法

3.2.1主要试剂及配制

3.2.2样品内源激素的提取

3.2.3样品激素含量测定

3.2.4统计分析方法

3.3结果与分析

3.4本章小结

4烟草愈伤组织叶片总RNA提取的改良盐酸胍法

4.1实验材料

4.2实验方法

4.2.1主要试剂及配制

4.2.2实验用品处理

4.2.3操作步骤

4.3结果与分析

4.3.1 RNA样品的质量检测

4.3.2 RNA样品的电泳检测

4.4本章小结

5烟草叶片愈伤组织诱导过程中Beclin-1基因的分子克隆与鉴定

5.1实验材料

5.2实验方法

5.2.1 cDNA的制备

5.2.2 RT-PCR

5.2.3 PCR产物的回收

5.2.4基因的克隆

5.2.5测序

5.2.6 Northern bloting

5.3结果与分析

5.3.1 RT-PCR结果及分析

5.3.2 Beclin-1基因的cDNA序列分析

5.3.3同源性比较

5.3.4 Northern blotting分析

5.4本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢