黄檗组织培养及转基因体系的建立

摘要

黄檗具有重要的经济和药用价值，由于黄檗的育苗条件要求较高，技术难度大，移栽成活率低，生长缓慢，成材年限长，因此在引种栽培上尚未大面积推广，野生资源缺乏，且目前存在自然更新困难、干形不通直、人工林种子败育等问题。本研究针对黄檗现有问题，利用黄檗成熟合子胚建立了黄檗的快速高效的组培体系和转基因体系，为黄檗优良品种的开发奠定了基础。 1．组织培养方面的研究表明：黄檗种子在6-BA和NAA作用下愈伤组织发生的最早，28℃条件下添加4.0 mg/LTDZ和0.2 mg/LNAA的培养基中不定芽诱导率最高，为92.93％，平均诱导的不定芽个数最多，为25.03。最有利于黄檗不定芽生长的基本培养基配比为添加2％蔗糖的1/2 MS培养基。添加4.0 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA的培养基对不定芽的伸长生长最有效，两周净生长量达到3.75 cm。添加1.0 mg/L IBA的培养基中不定芽根的诱导率最高，达到85％。添加1.0 mg/L2,4-D或添加4.0 mg/LTDZ和0.2 mg/LNAA的培养基中诱导出体细胞胚，诱导率分别为16.67％、1.22％和32.26％和2.02％。黄檗的胚乳在添加4.0 mg/LBA和0.2 mg/LNAA的培养基中诱导出一棵不定芽。 2．黄檗转基因体系建立的研究表明：侵染时将种子纵切成两半的方法既有利于农杆菌的侵染，又能获得较高的抗性芽诱导率。抗性芽诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素和10 mg/L的卡那霉素。最佳的共培养时间为28℃2d+4℃2d，抗性芽诱导率达38.8％。共培养时期保留胚乳，共培养结束后清洗过程中剥离胚乳再转入抗性芽筛选培养基能获得更高效的抗性芽诱导率，并容易控制试验材料外部菌类的生长。抗性芽在增殖及伸长生长过程中，芽基部愈伤组织块切成约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm左右为宜。试验共获得70个转化子，进行DNA水平上的PCR，结果均为阳性。随机挑选其中的5个黄檗转基因植株进行PCR-southem检测，RNA水平上的RT-PCR检测，结果显示外源的LEA基因已经整合到黄檗的染色体基因组中，在转基因株系中已经转录为mRNA，获得了转基因植株。

目录

文摘

英文文摘

声明

1绪论

1.1植物组织培养及植株再生

1.1.1器官发生

1.1.2体细胞胚发生

1.2植物转基因

1.2.1根癌农杆菌

1.2.2影响因子

1.3植物晚期胚胎富集蛋白基因(lea)研究现状

1.4黄檗生物学特性

1.5黄檗属植物研究进展

1.6研究目的和意义

2高效再生体系建立

2.1材料与方法

2.1.1试验材料及设备

2.1.2不定芽的诱导、增殖、抽茎和生根

2.1.3体细胞胚诱导

2.1.4胚乳培养

2.1.5液体培养

2.1.6培养条件及数据统计

2.2结果与分析

2.2.1芽的诱导

2.2.2不定芽的生长

2.2.3根的生长

2.2.4不同激素对愈伤组织和体细胞胚诱导的影响

2.2.5胚乳愈伤组织及芽的诱导

2.2.6液体培养

2.3本章小结

3高效黄檗转基因体系建立

3.1试验材料与方法

3.1.1试验材料与药品

3.2试验方法

3.2.1抗生素浓度测定

3.2.2根癌农杆菌介导的LEA基因的黄檗遗传转化

3.2.3培养条件及数据统计

3.3结果与分析

3.3.1不同浓度头孢对愈伤组织及芽诱导的影响

3.3.2 Kan对黄檗愈伤组织及芽诱导的影响

3.3.3共培养时间对黄檗愈伤组织及芽诱导的影响

3.3.4抗性芽的伸长生长及生根

3.4本章小结

4黄檗转基因植株的分子检测

4.1试剂

4.1.1 DNA提取试剂

4.1.2杂交检测试剂

4.1.3 RNA提取试剂

4.1.4酶类

4.2实验方法

4.2.1黄檗转lea基因植株PCR检测

4.2.2探针的制备

4.2.3 PCR-Southen检测

4.2.4 RT-PCR检测

4.3结果与分析

4.4本章小结

5讨论

5.1高效组培体系的建立

5.1.1实验材料的选择

5.1.2植物生长调节剂对黄檗不定芽诱导、增殖、生长及生根的影响

5.1.3胚乳培养

5.2遗传转化过程中影响抗性芽诱导和生长的因素

5.3黄檗转基因植株的分子检测

结论

参考文献

图版

攻读学位期间发表的学术论文

致谢