蓝狐(Alopex lagopus)微卫星位点的筛选及遗传特征的初步评价

摘要

蓝狐（Alopex lagopus）、银狐（Vulpes logpus）是我国重要的毛皮经济动物，其饲养历史悠久，但我国蓝银狐饲养存在谱系管理不清、近亲繁殖、遗传管理不合理等许多问题。而微卫星DNA在研究遗传多样性分析、基因组作图、QTL定位、疾病诊断与病理研究、亲缘关系鉴定及个体识别等方面发挥着巨大的作用，因此将微卫星引入到蓝银狐的饲养当中可以很好的解决以上问题。然而目前国内外对狐类动物的微卫星分离的研究很少。
　　本文以蓝狐基因组DNA样品为材料，经Sau3 AⅠ酶切并电泳后回收300bp～900bpDNA片段，经过与生物素标记的(CA)15探针杂交，再用MagneSphere(@)MagneticSeparation Products磁珠（购自Promega公司）富集和PCR扩增后，构建了微卫星富集文库。利用PMD-18载体上的序列设计一条引物分别与(CA)10N、(TG)10N进行PCR反应来检测阳性克隆，并将阳性克隆送去测序。共得到55个含有微卫星的序列。筛选并选择了6个多态性较好微卫星序列，利用丙烯酰胺凝胶分析了饲养条件下蓝狐、银狐对各个位点等位基因数目、等位基因片段大小范围、等位基因频率分布、观察杂合度等指标，结果显示:6对微卫星引物的在30个蓝狐样本中平均有效等位基因数(Ne)，介于1.3245～5.7515，平均值为3.2594;期望杂合度介于0.245～0.8261之间，平均值为0.507;观望杂合度介于0.1613～0.8125之间，平均值为0.4751;多态信息含量介于0.24～0.8001之间，平均多态性信息含量为0.5115。6个微卫星位点在30个银狐样本中平均有效等位基因数(Ne)介于1～5.3248之间，平均值为2.9578;期望杂合度介于0～0.8122之间，平均值为0.5487;观望杂合度介于0～0.6之间，平均值为0.3404;多态信息含量介于0～0.7455之间，平均多态性信息含量为0.4161。
　　通过上述诸方面的分析研究，得到以下结论:通过筛选得到的这6个微卫星位点可以作为分析蓝狐、银狐遗传多样性的研究;蓝狐的遗传多样性较好，银狐需要对种源进行改良。

目录

摘要

1 绪论

1．1 微卫星的介绍

1．1．1 微卫星的特点与分布

1．1．2 微卫星位点的多态性

1．2 微卫星序列的应用

1．2．1 遗传图谱的构建

1．2．2 数量性状位点(QTL)定位

1．2．3 标记辅助选择与谱系认证

1．2．4 种群遗传结构的研究

1．2．5 种群内个体识别

1．2．6 种群动态研究

1．2．7 遗传多样性的研究

1．2．8 微卫星在医学和法学中的应用

1．2．9 微卫星在蓝狐(Alopex lagopus)中的应用及引入到我国狐狸养殖中的意义

1．3 微卫星DNA的检测及分离方法的研究

1．3．1 微卫星DNA的检测

1．3．2 微卫星序列分离方法

1．4 本研究的内容与意义

1．5 本章小结

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 样品采集

2．1．2 试剂盒和主要药品

2．1．3 主要试剂的配置

2．1．4 主要仪器

2．2 微卫星的筛选

2．2．1 篮狐肌肉样品DNA的提取

2．2．2 限制性内切酶酶切蓝狐基因组DNA及酶切片段的回收

2．2．3 回收目的片段与接头的连接

2．2．4 基因组第一次扩增

2．2．5 磁珠的富集

2．2．6 含有微卫星序列的单链DNA片段的扩增

2．2．7 短片段基因组文库的构建

2．3 测序及引物设计

2．3．1 测序与引物设计

2．3．2 引物退火温度及微卫星位点多态性的筛选

2．4 丙烯酰胺凝胶电泳和银染

2．4．1 凝胶的制备

2．4．2 凝胶的电泳

2．4．3 凝胶的银染

2．5 数据分析

2．6 本章小结

3 实验结果

3．1 微卫星的筛选

3．1．1 样本DNA的提取

3．1．2 蓝狐基因组DNASau3A Ⅰ内切酶的酶切与酶切片段的选择回收

3．1．3 胶回收片段连接接头后PCR扩增检测

3．1．4 磁珠富集目的DNA片段的PCR扩增

3．1．5 阳性克隆的PCR检测及测序

3．2 15个微卫星位点的引物设计

3．3 11对引物的退火温度筛选

3．4 丙烯酰胺凝胶电泳

3．5 等位基因频率

3．6 平均有效等位基因、期望杂合度、观望杂合度及样本平均等位基因数

3．7 多态信息含量

3．8 本章小结

4 讨论

4．1 微卫星的筛选

4．1．1 方法的选择

4．1．2 DNA的提取

4．1．3 酶的选择及酶切片断的选择

4．1．4 酶的用量及酶切时间的选择

4．1．5 接头与酶切片段的连接

4．1．6 微卫星的富集

4．1．7 含有微卫星序列克隆菌落的检测

4．2 基因型的检测方法

4．3 基因型的判读

4．4 饲养条件下蓝、银狐小群体的遗传多样性

4．4．1 微卫星的多样性

4．4．2 杂合度、多态信息含量和有效等位基因数

4．5 管理建议

4．6 研究展望

4．7 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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