落叶松枯梢病的生物防治与分子检测初步研究

摘要

本文研究了长白山、完达山、小兴安岭地区落叶松枯梢病梢栖真菌的群落结构，应用形态学和分子生物学的方法对真菌进行了鉴定，并利用所分离到的真菌筛选出拮抗菌株并进行了林间生物防治试验;以梢栖真菌的序列为基础，针对落叶松枯梢病(Botryosphaeria laricina(Sawada) Y.Z.Shang)设计特异引物，初步探索出了落叶松枯梢病分子检测的方法。
　　(1)用形态学和分子生物学的方法，对落叶松枯梢病病原真菌（B.laricina）进行鉴定，并获取NCBI基因登录号:EU442284。经DNAman比对小兴安岭地区、长白山地区、完达山地区三个地点所获得的菌株，ITS区域相似度为100％。
　　(2)从落叶松病/健康梢上共分离到子囊菌3属（Botryosphaeria、 Chaetomium和Sordaria），有丝分裂菌15属。夏季梢栖真菌与冬季梢栖真菌相比，多出7种有丝分裂菌。冬季落叶松枯梢病/健康梢上分离率最高的为Alternaria，Pestalotiopsis，以及Epicoccum，分别为32.2％，21.8％和19％;夏季落叶松枯梢病/健康梢上的优势种类为Alternaria，其次为Tolura和Epicoccum，其分离率分别为32.0％，18.0％和14.0％。3年生病梢上种类略为丰富，而1年生健康枝条上种类相对较少。B.laricina主要分布于1年生梢部;健康及感病未发病的2、3年梢部，均有Chaetomium、Sordaria和Trichoderma出现，各个季节病/健康梢均部有分布的种有:Epicoccum、Alternaria、Trichoderma、Chaetomium和Sordaria，共5属。
　　(3)根据拮抗系数、抑菌率、被覆盖程度和防治预试验的综合评价确定Sordaria fimicola、Trichoderma atroviride和Chaetomium globosum为生防菌。野外防治试验表明，综合比较防治效果为S.fimicola＞代森锰锌400倍液＞T.atroviride＞C.globosum。三种菌剂在50％喷洒浓度时，真菌多样性最大;防治区真菌群落数量明显少于非防治区群落数量;非防治区同期梢栖真菌分离结果显示在健康梢部，分离到大量Trichoderma、Chaetomium，说明在自然界中Trichoderma、Chaetomium本身对B.laricina有较强的抑制作用。
　　(4)通过对落叶松梢栖真菌ITS序列的分析，设计出特异引物ITSA1与ITSB1。该特异引物可以将落叶松枯梢病病原菌与其它9种（属）落叶松梢栖真菌分别开，具有较好的特异性和较高的灵敏性，初步建立了落叶松枯梢病的分子检测方法。

目录

摘要

1 绪论

1．1 落叶松及其主要病害

1．2 落叶松枯梢病

1．2．1 落叶松枯梢病的发生情况

1．2．2 落叶松枯梢病的症状

1．2．3 落叶松枯梢病病原及发病规律

1．2．4 落叶松枯梢病病原的形态特点

1．2．5 落叶松枯梢病研究进展

1．3 梢栖真菌

1．4 植物生物防治技术进展

1．4．1 生防菌的生防机制

1．4．2 生防菌的发展及两种重要生防菌

1．5 真菌检测技术的进展

1．5．1 常规检测鉴定方法

1．5．2 生物技术在检测鉴定中的应用

1．6 真菌分子检测技术

1．6．1 DNA提取

1．6．2 ITS-PCR检测

2 落叶松枯梢病病原菌分离与鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 供试材料的采集

2．1．2 病原物常规鉴定

2．1．3 病原分离物的分离纯化

2．1．4 DNA操作与序列分析

2．2 结果与分析

2．2．1 病原物形态学鉴定

2．2．2 病原分离物的分离纯化

2．2．3 通用引物对落叶松葡萄座腔菌PCR扩增

2．3 小结

3 梢栖真菌群落

3．1 材料与方法

3．1．1 供试材料的采集

3．1．2 供试材料的分离纯化

3．1．3 分离物的形态鉴定

3．1．4 梢栖真菌DNA提取

3．1．5 梢栖真菌通用引物PCR扩增

3．2 结果与分析

3．2．1 梢栖真菌菌属描述

3．2．2 分离结果分析

3．3 小结

4 落叶松枯梢病生物防治

4．1 材料与方法

4．1．1 供试菌株

4．1．2 拮抗菌株筛选

4．1．3 落叶松枯梢病防治预试验

4．1．4 T．atroviride、C．globosum、S．fimicola林间防治试验

4．1．5 防治后梢栖真菌分离

4．1．6 非防治区同期梢栖真菌分离

4．2 结果与分析

4．2．1 对峙培养观察结果与拮抗系数测定

4．2．2 落叶松枯梢病防治预试验

4．2．3 T．atroviride、C．globosum、S．fimicola林间防治试验

4．2．4 防治后梢栖真菌分离结果

4．2．5 非防治区同期梢栖真菌分离结果

4．2．6 防治区与非防治区一年生梢栖真菌比较

4．3 小结

5 落叶松枯梢病分子检测初步研究

5．1 材料与方法

5．1．1 菌种选择

5．1．2 落叶松葡萄座腔菌特异引物的设计及验证

5．1．3 巢式PCR扩增及引物灵敏度检测

5．2 结果与分析

5．2．1 落叶松葡萄座腔菌特异引物的设计及验证

5．2．2 巢式PCR扩增及引物灵敏度检测

5．3 小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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