以PMI基因为选择标记露地菊转PtDHAR基因体系的建立

摘要

露地菊(Chrysanthemum morifolium)是园林绿化观赏植物中常用的花卉之一。其显著的特点是植株低矮,覆盖力强,繁殖容易,管理粗放,适应范围广,抗逆性强,花色丰富,花多而密,花期长,观赏价值高。在我国东北盐碱地区以及城市盐渍化严重的地区,大部分栽植的露地菊受盐碱的影响则表现出叶色萎黄、生长不良、花芽分化受阻甚至死亡的现象。本研究旨在利用安全标记的遗传转化方法获得转化植株,培育出抗盐碱能力更强的新品系,丰富盐碱地区花卉种植品种,提高盐碱地区花卉种植业收益水平。
　　 研究利用Gateway技术,以磷酸甘露糖异构酶基因PMI为选择标记,以盐生植物星星草中克隆的耐盐碱相关基因PtDHAR为目的基因,构建pCAMBIA1301-PMI-PtDHAR双元表达载体,并将此载体转入农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导的方法,把耐盐基因PtDHAR转入露地菊‘火焰’基因组中。
　　 主要研究结果如下:
　　 (1)遗传转化载体的构建。从大肠杆菌中通过PCR克隆PMI基因全长,装入pGEM(R)-T-Vector载体中,利用限制性内切酶XhoI单酶切,以PMI-T载体和pCAMBIA1301载体为基础,构建pCAMBIA1301-PMI载体;利用Gateway技术构建pCAMBIA1301-PMI-PtDHAR双元表达载体,并将此载体转入到农杆菌菌株EHA105中,通过PCR验证结果表明pCAMBIA1301-PMI-PtDHAR载体已成功转入农杆菌菌株EHA105中。
　　 (2)露地菊‘火焰’对甘露糖和头孢霉素的敏感性试验。研究结果当甘露糖浓度为10 g/L时即能明显抑制叶片外植体的分化和不定芽的产生,可以作为遗传转化时叶片外植体筛选培养的临界耐受浓度;分化率和不定芽增殖系数随着头孢霉素(Cef)浓度的升高而逐渐下降,300 mg/L的Cef浓度可作为叶片外植体在共培养后抑制农杆菌的抑菌浓度。
　　 (3)露地菊‘火焰’遗传转化体系的建立。以预培养1d的叶片外植体为转化材料,用OD600值为0.4的农杆菌菌液侵染10min,在23～25℃黑暗条件下共培养2d,随后进行2d延迟培养,接下来以300mg/L的Cef浓度为抑菌浓度,采用选择压递增的方式进行筛选,初期筛选培养基的甘露糖浓度为8g/L,后期筛选培养基中甘露糖的浓度增加到10g/L,连续筛选至不定芽产生。把不定芽转入甘露糖浓度为10g/L、Cef浓度为100mg/L的生根筛选培养基中继续筛选,直至长势健壮并生根的抗性植株产生。
　　 (4)转化植株的检测。对获得的9株抗性植株进行PCR检测,结果表明获得了2株转PtDHAR基因植株。