小鼠UHS启动子-蜘蛛拖丝蛋白基因表达载体构建及其在体细胞中整合

摘要

为了建立通过哺乳动物被毛获取蜘蛛丝的方法,本研究以小鼠为动物模型,利用研究室前期工作中获得的蜘蛛拖丝蛋白二聚体、小鼠皮肤特异性启动子UHS和构建的UHS-2S-3.1重组质粒.构建在机体中广泛表达的CMV-2S-pIRES2-EGFP质粒和在皮肤上特异表达且可通过报告基因GFP便于检测的UHS-2S-pIRES2-EGFP重组质粒,分别在转染小鼠颗粒细胞和小鼠胎儿皮肤成纤维细胞基础上,通过G418筛选并经PCR法鉴定,检测其在基因组中整合情况。其结果:
　　 (1)蜘蛛拖丝蛋白基因真核表达载体的构建:将二聚化拖丝蛋白基因与载体pIRES2-EGFP相连接,获得表达载体CMV-2S-pIRES2-EGFP;通过特异性引物将角蛋白启动子UHS扩增,连接到切除自身CMV病毒启动子的CMV-2S-pIRES2-EGFP载体上,获得拖丝蛋白基因真核表达载体UHS-2S-pIRES2-EGFP。
　　 (2)颗粒细胞的转染与筛选:利用幼鼠颗粒细胞,通过体外培养,可获得最佳的原代贴壁时间、传代速率、细胞形态和冷冻复苏后活性等指标的细胞株;用线性化的UHS-2S-3.1载体转染到颗粒细胞后,经13418筛选并通过PCR鉴定证实,细胞基因组中整合含有UHS-2S-3.1。
　　 (3)成纤维细胞的转染与筛选:采用常规方法建立小鼠皮肤成纤维细胞系;用线性化的CMV-2S-pIRES2-EGFP以及UHS-2S-pIRES2-EGFP载体转染成纤维细胞并进行G418抗性筛选扩增的阳性细胞,经对其基因组DNA的PCR鉴定,确认基因组整合均带有目的基因。
　　 上述研究结果,为利用UHS-2S-pIRES2-EGFP重组质粒,采用原核显微注射法或者通过体细胞核移植法获得在被毛特异表达蜘蛛拖丝蛋白的转基因鼠,最终建立通过绵羊被毛获取蜘蛛拖丝蛋白的新方法奠定基础。