环境胁迫对长春花TIAs生物合成的调控及相关基因表达分析

摘要

生物碱（Alkaloids）是植物天然次生代谢产物中数量最多的一类含氮碱性化合物。许多生物碱由于具有特殊的药理学活性已引起人们越来越多的关注。长春花(Catharanthusroseus)中含有长春碱(Vinblastine，VBL)、长春新碱(Vincristine，VCR)等重要的抗肿瘤萜类吲哚生物碱（Terpenoid indole alkaloids，TIAs），成为近年来生物制药领域的热点，并被确定为研究植物次生代谢的模式植物。
　　长春花为喜光性植物，性喜高温高湿，耐半阴。近年来，不少学者从改变长春花的环境因素方向进行研究，发现长春花植株体中吲哚生物碱的积累量的高低和环境因子有关。光和干旱胁迫等环境因子改变TIA生物合成和积累过程中的代谢流向，但从生物碱合成的环境调控机理和相关因表达影响方面研究比较少，本文一方面利用红色遮光膜遮荫的方法，对长春花的无菌苗进行处理，检测叶片中色素含量和生物碱含量变化以及生物碱合成相关基因的表达，探讨叶绿素含量变化和相关基因表达与生物碱积累的关系。采用同样的红膜遮盖处理长春花实生苗，对叶片色素含量和生物碱合成相关基因表达的分析，以及生物碱含量测定，综合两种处理，阐明光质和光强对长春花生物碱积累的调控机理;另一方面，运用植物生理生态学理论和方法，研究长春花在6种不同浓度PEG6000模拟干旱胁迫下的脯氨酸含量和叶片相对含水量的变化情况，进而在优化PEG6000模拟干旱胁迫下，研究叶片POD活性、生物碱含量和相关基因的表达，并且分析与细胞壁降解相关的果胶甲基酯酶(Pectin methylesterase，PME)的基因的表达变化，探讨渗透胁迫对生物碱合成的调控机理。
　　主要实验结果如下：
　　(1)通过HPLC方法测定红膜处理长春花无菌苗和对照叶片中生物碱含量，文多灵(Vindoline，VIN)和长春质碱（Catharanthine，CAT）的含量缓慢上升后逐渐下降，并且低于对照;耦合VIN和CAT的产物VBL含量均逐渐高于对照，在处理第15天达到最高，通过SQ-RT-PCR测定长春花生物碱代谢途径中5个关键基因的表达水平，通过Quantify One软件数量化电泳结果，数据分析表明低光环境对G10h基因表达影响不明显，相关性分析得出D4h和Dat基因表达水平较好的反映TIA合成路径的文多灵的积累，Tdc和Str基因表达水平较好的反映长春质碱积累，调控是在转录水平发生。因此在研究工作中，通过分析关键基因的表达水平快速准确地推测长春花中对应生物碱的含量。
　　(2)相同的红色滤光膜遮光处理长春花实生苗，综合分析两种处理低光环境下的光质和光强，透过膜的光强下降幅度基本相同。在一定时间Tdc， Str，D4h和Dat基因表达与对应的VIN和CAT的含量有相关性。红膜诱导的低光环境，一定时间有利于VIN和CAT含量合成和积累。对比两种环境下色素含量:类胡萝卜素含量和叶绿素含量变化明显不同，推测调节长春花体内激素含量变化，因而影响长春碱的生物合成。
　　(3)通过6种不同浓度PEG6000胁迫处理长春花，通过茚三酮比色法测定脯氨酸含量，测定叶片相对含水量，结果表明:相同浓度PEG6000处理下，随着胁迫时间的延长，叶片相对含水量下降——上升的趋势和脯氨酸含量缓升——急升的趋势。相同时间下，随着PEG浓度增强，叶片相对含水量和脯氨酸含量变化的差异越显著，综合二因素的差异显著分析，本研究选择35％PEG6000模拟干旱胁迫处理长春花。
　　(4)35％浓度PEG6000模拟干旱胁迫长春花幼苗，叶片中POD活性逐渐增强，有利于VIN和CAT向VBL的合成。干旱胁迫下，长春花叶片中的文多灵含量和长春质碱含量下降，长春碱含量逐渐升高24 h达到峰值。说明POD受渗透胁迫的影响，活性增强，调节单吲哚生物碱向双吲哚生物碱的转化。在一定时间Tdc，Str和Dat基因的转录水平的积累，对应的酶将被激活，进一步反映了基因表达与对应的单吲哚生物碱生物碱之间的相关性，确定TIAs生物合成和积累代谢瓶颈，对更好的开发利用长春花的药用资源有很大的实践意义和理论价值。
　　(5)细胞壁是植物细胞最基本的组成结构，它在植物细胞的生长发育、环境胁迫、细胞内及细胞间的信息传递中起着非常重要的作用。PME是一种能催化细胞壁的果胶去酯化生成果胶酸和甲醇的胞外酶，改变细胞壁的结构组成。在长春花中克隆Pme基因，利用生物信息学分析其功能，渗透胁迫下，分析Pme基因的表达变化，PME作为生物诱导子诱导和调节生物碱的合成。为深入研究环境调控机理提供新的方向。

目录

摘要

1 绪论

1．1 植物次生代谢产物

1．2 长春花萜类吲哚生物碱概述

1．3 长春花TIAs生物合成途径

1．4 TIAs生物合成途径中的关键酶及基因

1．4．1 色氨酸脱羧酶

1．4．2 香叶醇-10-羟化酶

1．4．3 异胡豆苷合成酶

1．4．4 脱乙酰文多灵-4-羟化酶

1．4．5 脱乙酰文多灵-4-乙酰转移酶

1．5 TIAs生物合成诱导和调控

1．5．1 光照

1．5．2 水分和盐分

1．5．3 植物生长调节物质

1．5．4 信号分子

1．5．5 生物诱导子

1．6 结论和展望

1．7 半定量RT-PCR技术在基因分析中的利用

1．7．1 引物的设计及选择

1．7．2 内参的选择

1．7．3 同管扩增或异管扩增的选择

1．7．4 PCR循环数的确定

1．7．5 其他因素

1．8 本课题研究的目的和意义

2 红色滤光膜对长春花无菌苗叶片长春碱含量和相关合成基因的影响

2．1 前言

2．2 实验材料、试剂与仪器和实验方法

2．2．1 长春花无菌苗的栽培

2．2．2 长春花的红色滤光膜的遣光处理

2．2．3 长春花叶片中叶绿素含量的测定方法

2．2．4 总RNA的抽提和半定量RT-PCR(SQ-RT-PCR)

2．2．5 长春花叶片中生物碱含量测定方法

2．3 结果与分析

2．3．1 红色滤光膜下的波长和辐射能量分析

2．3．2 无菌苗叶片中色素含量的分析

2．3．3 无菌苗叶片中相关基因的表达分析

2．3．4 生物碱含量分析

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 红色滤光膜对长春花实生苗叶片生物碱含量的影响

3．1 前言

3．2 实验材料、试剂与仪器和实验方法

3．2．1 长春花实生苗的栽培

3．2．2 长春花实生苗叶片中色素含量的测定方法

3．2．3 总RNA的抽提和半定量RT-PCR

3．2．4 长春花实生苗叶片中生物碱含量测定方法

3．3 结果与分析

3．3．1 红色滤光膜下的波长和辐射能量分析

3．3．2 红色滤光膜对长春花实生苗的色素含量变化的影响

3．3．3 红色滤光膜对实生苗叶片中生物碱合成相关基因表达的影响

3．3．4 红色滤光膜对实生苗叶片中生物碱含量的影响

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 长春花PEG6000模拟干旱体系的建立

4．1 前言

4．2 实验材料，试剂与仪器

4．2．1 长春花培养

4．2．2 主要仪器设备

4．2．3 试剂及药品

4．3 实验方法

4．3．1 脯氨酸(Proline，Pro)含量测定

4．3．2 叶片相对含水量的测定

4．4 结果与分析

4．4．1 不同浓度PGE处理对长春花叶片中脯氨酸含量的影响

4．4．2 PEG渗透胁迫对长春花叶片相对含水量(RWC)的影响

4．4．3 PEG6000渗透胁迫下脯氨酸含量和叶片相对含水量的差异分析

4．5 讨论

4．6 本章小结

5 PEG模拟干旱对长春花叶片生物碱含量、POD酶和相关基因表达的影响

5．1 前言

5．2 实验材料和方法

5．2．1 植物材料

5．2．2 长春花叶片中过氧化物酶(POD)活性的测定

5．2．3 PEG胁迫下长春花叶片中生物碱含量测定方法

5．2．4 总RNA的抽提和半定量RT-PCR

5．3 结果与分析

5．3．1 35％PEG6000模拟干旱对长春花幼苗叶片中POD酶活性影响

5．3．2 35％PEG6000模拟干旱对长春花幼苗叶片中3种生物碱含量的影响

5．3．3 35％PEG6000模拟干旱对长春花幼苗叶片中重要合成基因(Tdc、Str和DaD的表达影响

5．4 讨论

5．5 本章小结

6 PEG胁迫下长春花Pme基因的克隆和表达

6．1 前沿

6．1．1 果胶甲基酯酶与细胞壁的关系

6．1．2 果胶甲基酯酶调节植物果实的成熟

6．1．3 果胶甲基酯酶在植物花粉管发育中的作用

6．1．4 4果胶甲基酯酶的表达与边缘细胞产生以及抗逆境胁迫的作用

6．1．5 结论和展望

6．2 实验方法

6．2．1 RNA的提取

6．2．3 RT-PCR扩增基因

6．2．4 PCR产物的回收

6．2．5 基因的克隆

6．2．6 测序

6．2．7 渗透胁迫下Pme基因的半定量RT-PCR

6．3 结果与分析

6．3．1 长春花Pme基因的RT-PCR扩增结果及分析

6．3．2 长春花Pme基因的RT-PCR扩增结果及分析

6．3．3 Pme基因在长春花组织中的表达

6．3．4 渗透胁迫对长春花Pme基因表达的影响

6．4 讨论

6．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

个人简历

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