转蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体绵羊成纤维细胞株的筛选

摘要

蜘蛛丝是目前已知的一种集多种优良性能于一身的纤维，无论与其它天然材料还是人工合成的材料相比，蜘蛛丝都显示出了绝对的优势。但是由于蜘蛛的生活习性以及织网特点，无法通过人工进行大规模饲养繁殖，这些都给蜘蛛丝的大量获取造成了巨大困难。本研究通过绵羊可以产生由角蛋白构成的羊毛为启迪，利用本实验室前期合成的蜘蛛丝蛋白基因二聚体和绵羊毛发角蛋白启动子B2C，将B2C与报告基因相连，验证其是否具有表达活性，并将绵羊毛发角蛋白启动子与pcDNA3.1相连构建真核表达载体，再与蜘蛛丝蛋白基因二聚体相连后转染绵羊皮肤成纤维细胞，经抗性筛选后扩大培养，建立转拟蜘蛛丝蛋白基因二聚体绵羊皮肤成纤维细胞系。为后续产生被毛中表达蜘蛛拖丝蛋白的转基因绵羊奠定了基础。实验的结果与结论如下:
　　(1)绵羊毛发角蛋白启动子B2C的活性检测:将绵羊毛发角蛋白启动子pEasy-T3-B2C与报告基因GFP相连，构建重组质粒B2C-GFP，将其转染绵羊皮肤成纤维细胞。结果在蓝光激发下观察到了绿色荧光，证明了该启动子在绵羊皮肤成纤维细胞中具有表达活性;
　　(2)真核表达载体的构建:将去除自身CMV巨噬细胞病毒启动子的pcDNA3.1与经过相同酶切的启动子B2C相连接，再与蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体2S相连接，成功构建了真和表达载体pcDNA3.1-B2C-2S;
　　(3)转基因阳性细胞的筛选:通过脂质体转染法将线性化的pcDNA3.1-B2C-2S转染绵羊皮肤成纤维细胞，用最适终浓度的G418对转染后的细胞进行筛选，得到了生长状态良好的转基因细胞;
　　(4)转基因细胞的检测:提取转基因细胞的基因组DNA，通过PCR检测显示pcDNA3.1-B2C-2S整合到了绵羊皮肤成纤维细胞的基因组中，将转基因细胞进行冻存与复苏，复苏后的细胞生长状态依然良好。
　　通过以上叙述可知，本研究获得了转蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体绵羊皮肤成纤维细胞系。

目录

摘要

1 绪论

1．1 蜘蛛丝蛋白的相关研究

1．1．1 蜘蛛丝在自然界的存在情况

1．1．2 蜘蛛丝的理化性质与机械性质

1．1．3 蜘蛛丝在基因结构、蛋白质组成上的特点

1．1．4 蜘蛛丝的研究现状及其应用前景

1．2 哺乳动物的毛发角蛋白

1．2．1 角蛋白的种类

1．2．2 角蛋白基因

1．2．3 角蛋白的结构

1．2．4 角蛋白与羊毛

1．3 真核生物中的启动子

1．3．1 启动子的种类和结构

1．3．2 RNA聚合酶的种类和作用

1．4 报告基因

1．4．1 如何选择合适的报告基因

1．4．2 报告基因的应用

1．4．3 常用的报告基因及其特点

1．5 哺乳动物体细胞

1．5．1 哺乳动物体细胞的类型

1．5．2 成纤维细胞

1．6 基因转染技术

1．7 本研究的目的意义

2 绵羊毛发角蛋白启动子B2C的活性检测

2．1 实验材料

2．1．1 实验细胞来源

2．1．2 实验菌株

2．1．3 实验所需试剂及其配制

2．1．4 实验所需仪器设备及其购买公司

2．1．5 实验载体信息图谱

2．2 实验具体步骤

2．2．1 绵羊毛发角蛋白启动子B2C在绵羊皮肤成纤维细胞中的活性检测

2．3 实验结果分析

2．3．1 绵羊毛发角蛋白启动子B2C在绵羊皮肤成纤维细胞中的活性检测

2．4 讨论

2．5 本章总结

3 真核表达载体的构建

3．1 实验材料

3．2 实验具体步骤

3．2．1 拟蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体(2S)的获得

3．2．2 B2C-pcDNA3．1-2S的构建及其线性化

3．3 实验结果分析

3．3．1 重组质粒pcDNA3．1-B2C的构建及检测

3．3．2 真和表达载体pcDNA3．1-B2C-2S的构建及检测

3．4 讨论

3．5 本章总结

4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染、筛选与鉴定

4．1 实验材料

4．2 实验具体步骤

4．2．1 绵羊皮肤成纤维细胞的培养

4．2．2 确定合适的G418浓度用于转基因细胞的筛选

4．2．3 线性化pcDNA3．1-B2C-2S转染绵羊皮肤成纤维细胞及其筛选

4．2．4 对筛选后的转基因细胞系进行检测

4．2．5 将转基因细胞进行冻存与复苏

4．3 实验结果分析

4．3．1 原代绵羊皮肤成纤维细胞的培养

4．3．2 确定筛选细胞时最适的G418浓度

4．3．3 线性化pcDNA3．1-B2C-2S转染绵羊皮肤成纤维细胞及其筛选

4．3．4 筛选后的转基因细胞系的生长曲线

4．3．5 转基因细胞基因组的检测

4．3．6 转基因细胞的冻存与复苏

4．4 讨论

4．5 本章小结

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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