DREB2B基因和RD20基因在露地菊遗传转化的研究

摘要

干旱是植物生长过程中遇到的一种非生物胁迫，在受到干旱胁迫时，转录因子就会调控某些与逆境或抗旱相关的基因，通过一系列的转录、翻译产生对细胞起重要保护作用的蛋白质等。RD20基因和DREB2B基因是应答干旱胁迫时重要的调控基因，在植物应答干旱胁迫方面扮演着重要的角色，可以激活许多逆境诱导基因的表达，增强植物对干旱逆境的忍耐力。磷酸甘露糖异构酶基因（PMI）是生物安全标记基因，无抗生素或除草剂抗性，对于转基因的植株无毒害作用。本研究采用磷酸甘露糖异构酶基因PMI为筛选标记基因，在已建立露地菊‘火焰’离体再生体系的基础上将津田芜菁RD20基因和拟南芥诱导转录因子DREB2B基因分别转入菊花中，并采用生物基因磷酸甘露糖异构酶基因PMI为筛选标记基因，为实现具有安全标记的抗旱性状得到改良的菊花品种奠定基础。
　　研究结果如下:
　　(1)克隆了津田芜菁RD20和拟南芥DREB2B基因。RD20基因cDNA序列全长为720bp，编码239个氨基酸的成熟多肽。RD20的分子量为26.9kD;等电点(PI)为5.10。DREB2B基因全长1434bp，开放阅读框993个碱基，5'-UTR和3'-UTR分别为228bp和213bp，编码330个氨基酸的成熟多肽。
　　(2)构建遗传转化载体:利用Gateway技术构建pCAMBIA1301-PMI-RD20和pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表达载体，经PCR和酶切验证后，将构建成功的植物表达载体电转化农杆菌EHA105，之后通过PCR验证表明pCAMBIA1301-PMI-RD20和pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表达载体成功转入农杆菌EHA105中。
　　(3) RD20基因和DREB2B基因露地菊‘火焰’的遗传转化:对植株外植体消毒处理及体外培养，建立露地菊‘火焰’茎段外植体的无菌再生体系，用目的基因的农杆菌菌液侵染叶片，并以NAA与6-BA作为生长激素，建立了叶片外植体再生体系。将叶片上生成的不定芽转入1/2 MS生根筛选培养基中继续筛选，直至长势健壮并生根的抗性植株产生。对采用磷酸甘露糖异构酶基因PMI为筛选介质得到露地菊‘火焰’的抗性植株进行PCR及Southern杂交检测，最终获得以甘露糖作为筛选介质对露地菊‘火焰’进行遗传转化后获得了抗性芽，其中转化津田芜菁RD20基因抗性植株各1株转化效率为2.2‰左右。拟南芥诱导转录因子DREB2B基因的阳性抗性植株各2株，转化效率为3.5‰左右。

目录

摘要

1 绪论

1．1 拟南芥诱导转录因子DREB2B基因和津田芜菁RD20基因

1．1．1 拟南芥诱导转录因子DREB2B基因的研究进展

1．1．2 拟南芥诱导转录因子DREB2B基因的作用机制

1．2 津田芜菁RD20基因

1．2．1 津田芜菁RD20基因的研究进展

1．2．2 津田芜菁RD20基因的作用机制

1．3 植物转基因选择标记系统的研究

1．3．1 传统型选择标记基因

1．3．2 生物安全标记基因研究现状

1．3．3 抗逆选择标记基因在植物转基因方面的应用

1．3．4 磷酸甘露糖异构酶基因PMI安全标记基因在植物转基因中的应用

1．4 菊花的转基因工程

1．4．1 转基因表达的稳定性

1．4．2 改变花色、形态及花期的基因工程

1．4．3 菊花抗逆基因工程的研究进展

1．5 研究的目的意义

2 津田芜菁RD20基因的克隆及植物表达载体pCAMBIA1301-PMI-RD20的构建

2．1 试验材料与试剂

2．1．1 试验材料

2．1．2 试验试剂

2．2 试验方法

2．2．1 RD2D基因克隆的方法

2．2．2 利用Gateway技术构建pCAMBIA1301-PMI-RD2D植物表达载体

2．2．3 pCAMBIA1301-PMI-RD20植物表达载体的农杆菌转化

2．3 结果与分析

2．3．1 RD20基因的克隆

2．3．2 pCAMBIA1301-PMI-RD20植物表达载体的构建

2．3．3 农杆菌转化菌株的鉴定

2．4 本章小结

3 拟南芥DREB2B基因克隆及pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表达载体的构建

3．1 试验材料和试剂

3．1．1 试验材料

3．1．2 试验试剂

3．2 试验方法

3．2．1 DREB2B基因克隆的方法

3．2．2 利用Gateway技术构建pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表达载体

3．3 结果与分析

3．3．1 DREB2B基因的克隆

3．3．2 pCAMBIA1301-PMI-DREB2B植物表达载体的构建

3．3．3 农杆菌转化菌株的鉴定

3．4 本章小结

4 露地菊“火焰”组培体系的建立

4．1 试验材料和试剂

4．1．1 植物材料

4．1．2 试验试剂

4．1．3 培养基和培养条件

4．2 试验方法

4．2．1 露地菊‘火焰’无菌苗体系的建立

4．2．2 露地菊‘火焰’无菌苗的继代培养

4．2．3 不定芽的诱导

4．2．4 不定芽的生根

4．2．5 农杆菌介导的叶盘法遗传转化及抗性苗筛选

4．2．6 根癌农杆菌的活化与菌液的制备

4．2．7 外植体培养

4．2．8 生根培养

4．2．9 露地菊抗性植株PCR检测

4．2．10 抗性植株Southern杂交检测

4．3 结果与分析

4．3．1 农杆菌介导的叶盘法遗传转化及抗性苗筛选结果

4．3．2 抗性植株PCR检测结果

4．4 本章小结

5 讨论

5．1 RD20基因和DREB2B基因的载体构建

5．2 农杆菌介导菊花遗传转化效率

5．3 磷酸甘露糖异构酶基因PMI安全标记基因的优点

5．4 抗性植株的假阳性问题

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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