野鸟源H5N2亚型禽流感病毒的分子克隆及遗传进化分析

摘要

研究发现，H5N2高致病性禽流感能够在家禽中散发，给当地养殖业带来经济损失。自然状态下，H5N2高/低致病性禽流感不仅能感染野鸟，也能感染包括人类在内的哺乳动物。H5N2低致病性禽流感病毒广泛存在于野鸟中，野鸟在禽流感的传播中起到了重要作用。对野鸟中H5N2亚型禽流感病毒的检测可能能够反映野鸟中病毒携带状态，并为H5N2亚型病毒的遗传变异提供重要信息。
　　2011年10月，本实验室于中国吉林省向海自然保护区采集了300份拭子样品，经过初步的病毒检测及鉴定，根据所分离宿主的不同选择了五株H5N2禽流感毒株，对其进行了克隆、全基因测序及分析。HA蛋白裂解位点所推导的氨基酸序列表明这五株禽流感毒株均为低致病性毒株。分析其某些毒力相关位点，发现了一些高致病性相关的氨基酸位点，可能对小鼠或猪具有高致病性。遗传进化树及核苷酸同源性分析表明这五株毒株所有的基因片段均位于欧亚分支，HA和NA的同源性高于六个内部基因(PB2，PB1，PA，M，NP和NS)的同源性。内部基因重排(gene reassortment)频繁发生于不同分离株的相同基因，或者同一分离株的不同基因。宿主亲缘关系的远近能够影响内部基因的重排，这五株毒株的基因组组成了三个不同的基因星座(gene constellation)，可能是由于生物分类学上的差异导致了429毒株（从小中分离）和其余四株毒株（从不同的野鸭中分离）基因星座之间明显的不同。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 禽流感病毒简介

1．2．1 P基因及其编码蛋白

1．2．2 HA基因及其编码蛋白

1．2．3 NP基因及其编码蛋白

1．2．4 NA基因及其编码蛋白

1．2．5 M基因及其编码蛋白

1．2．6 NS基因及其编码蛋白

1．2．7 A型流感病毒的进化原理

1．3 禽流感简介

1．3．1 禽流感的流行历史

1．3．2 禽流感的流行病学特征

1．4 流感病毒在野鸟中的分布情况

1．5 野鸟与禽流感

1．6 本课题研究的目的和意义

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验样品与动物

2．1．2 实验仪器与试剂

2．2 实验方法

2．2．1 病毒分离与鉴定

2．2．2 核酸提取及cDNA合成

2．2．3 RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳

2．2．4 PCR产物回收、纯化及鉴定

2．2．5 连接转化及细菌培养

2．2．6 单克隆培养及菌液PCR鉴定

2．2．7 基因序列测定及分析

3 实验结果与分析

3．1 病毒分离鉴定结果

3．2 RT-PCR琼脂糖凝胶电泳结果

3．3 测序结果

3．4 基因大小及编码氨基酸

3．5 HA和NA基因分析

3．5．1 基因遗传进化分析及同源性

3．5．2 HA基因裂解位点分析

3．5．3 HA和NA基因潜在糖基化位点

3．6 内部基因遗传进化分析

3．6．1 内部基因遗传进化树及同源性比较

3．6．2 内部基因重排现象

3．6．3 内部蛋白特殊位点分析

4 讨论

4．1 野鸟在流感病毒进化中的作用

4．2 本研究五株毒株基因重排现象及致病力分析

4．3 野鸟中流感病毒监测的重要意义

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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