山新杨高效遗传转化体系的建立及蒙古柳FOX山新杨抗性植株的获得

摘要

杨树是木本植物的模式植物，其遗传转化机理、转化方法和转化范围已有深入研究，并取得了较大的发展，同时也获得了不同品种的转基因植株，但在杨树遗传转化过程中，实际上是在进行大量的重复实验后，而得到了的少数几个转化子。FOX-Hunting System技术，即Full-length cDNA Over-eXpressor gene Hunting System（全长cDNA高效表达功能基因探索系统），该方法通过把全长cDNA高效率地导入植物中，使其基因过量表达并导致表型发生变化，达到明确基因功能的目的。本文为将FOX hunting system技术应用在木本植物杨树中，建立高效率的杨树遗传转化体系具有现实意义。成功的植物基因转化首先需要依赖一个良好的再生体系的建立，而理想受体系统的建立则与植物的组织培养分不开。本文以山新杨(Populus davidiana Dode×Populus bollenaLauche)叶片为实验材料，建立了高效的山新杨再生体系，在此基础上，建立了一个高效的遗传转化体系。使用建立的山新杨高效的遗传转化体系，将已构建的蒙古柳cDNA农杆菌表达文库，转入山新杨中，获得了大量的蒙古柳FOX山新杨抗性植株，并对获得的大量的抗性植株进行耐盐碱性的初步筛选，获得了较为耐盐碱的转基因品种，为在木本植物中利用FOX hunting system技术筛选功能基因打下基础。具体实验结果如下:
　　建立了一个高效的山新杨再生体系，为山新杨的遗传转化奠定基础。
　　(1)以2％的NaClO作为消毒剂，消毒不同的时间，筛选较好的消毒时间，结果显示使用2％的NaClO作为消毒剂，消毒15min可以达到较好的消毒效果。
　　(2)使用6-BA(0.1，0.3，0.5mg/L)和NAA(0.01，0.03，0.05，0.08，0.1mg/L)两种激素进行不同浓度的组合，筛选出具有较高分化率的山新杨叶片分化培养基，结果显示，山新杨叶片在1/2 MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.08mg/L分化培养基上，具有最高的分化率，分化率达到90％以上。
　　(3)将分化出丛生芽的叶片外植体接种于含有6-BA（0.3，0.5，0.8 mg/L）和NAA(0.05，0.1，0.15 mg/L)两种激素进行不同浓度组合的壮苗培养基上进行壮苗，以提高生根率，筛选得到较优的壮苗培养基。实验结果表明最佳壮苗培养基为1/2 MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1mg/L。
　　(4)我们将分化出的丛生芽分成单芽，接种于含有不同浓度的NAA(0.1，0.2，0.25，0.3，0.4 mg/L)培养基中，筛选较优的生根培养基，结果显示，山新杨芽在1/2 MS+NAA0.25mg/L培养基中生根，生根率为100％，且根系粗细适中，分根多且根系长势快。
　　(5)将在培养基中生根长大的山新杨组培苗进行炼苗和移栽，获得盆栽山新杨植株，移栽成活率达到90％以上。
　　以高效的山新杨再生体系为基础，建立了一个高效的山新杨遗传转化体系，为获得大量的cDNA文库转基因植株提供成熟的技术。
　　(1)卡那霉素(Kan)作为遗传转化过程中的筛选标记，对Kan的不同浓度进行筛选，选择较适合的浓度应用于遗传转化中。实验结果表明，30mg/L作为筛选培养山新杨叶片分化的筛选压较为合适;40mg/L作为山新杨生根筛选的适宜浓度。头孢噻亏钠(Cef)作为遗传转化中的抑菌剂，可以抑制根癌农杆菌的生长，但也影响植物的正常生长发育，实验结果表明选用200 mg/L的Cef作为筛选山新杨抗性苗的抑菌剂浓度较为合适。
　　(2)对不同菌液浓度(OD600=0.6，0.8，1.0，1.2)和侵染时间(10min.20min30min,40min)对山新杨进行遗传转化的影响进行了实验，并对实验样品表面的农杆菌的附着情况进行了扫描电镜的观察，实验结果表明在遗传转化过程中菌液浓度选定在0.8-1.0之间，侵染时间在20-30min为适宜。
　　(3)对乙酰丁香酮(AS)在共培养培养基中所起的效果做了研究，结果显示在遗传转化过程中，共培养培养基中添加AS对遗传转化效率存在一定的影响，但效果不明显。
　　(4)在上述(1)-(3)中筛选的最优条件处理下，研究了不同叶龄(30d，60d，90d)的山新杨叶片对遗传转化效率的影响，并对实验样品表面农杆菌的附着情况和内部农杆菌的侵入情况进行了扫描电镜和透射电镜的观察，筛选出了适合于杨树遗传转化的叶片外植体年龄。实验结果表明30d大小的叶片作为遗传转化的外植体可明显提高山新杨的遗传转化效率。扫描电镜实验结果观察到30d大小的叶片表面在遗传转化过程中所附着的农杆菌的量较60d，90d的叶片外植体多。透射电镜的进一步实验结果表明30d大小的叶片作为外植体时，叶片内部侵入的农杆菌的数量均多于60d和90d的叶片外植体。实验结果表明使用30d大小的山新杨叶片作为遗传转化的外植体，可提高遗传转化效率。综上优化因素，遗传转化效率高达30％以上。本部分实验使用pBI-121-MD-GFP基因作为植物遗传转化的指示报告基因，进行遗传转化，分化出的芽可在荧光显微镜下进行观察，激发出荧光。并选择部分转基因植物进行Southern Blot和Northern Blot实验，进一步验证该基因转入了山新杨中并得到了表达。
　　实验使用建立的高效的遗传转化方法，将已构建得到的蒙古柳(Salix linearistioularisHao) cDNA农杆菌文库转入到山新杨中，获得了218株蒙古柳FOX山新杨抗性植株。同时将抗性植株进行耐盐碱性的初步筛选，初步获得了2个抗NaCl，2个抗NaHCO3的山新杨抗性品种。并将具有抗性的植株进行移栽，以备后续实验的进行。

目录

摘要

1 绪论

1．1 杨树简介

1．2 国内外建立杨树组织培养再生体系研究进展

1．2．1 国外杨树组织培养再生体系研究进展

1．2．2 国内杨树组织培养再生体系研究进展

1．3 植物基因工程研究的意义

1．4 杨树遗传转化受体系统研究进展

1．5 建立杨树遗传转化体系研究进展

1．5．1 农杆菌介导法简介

1．5．2 DNA直接导入技术

1．6 杨树遗传转化的影响因素研究

1．6．1 杨树基因型的不同对遗传转化效率的影响

1．6．2 农杆菌的类型对转化效率的影响

1．6．3 选择压对杨树转化效率的影响

1．6．4 外界因素对杨树转化效率的影响

1．6．5 转化受体对杨树转化效率的影响

1．6．6 Vir基因的活化对杨树转化效率的影响

1．6．7 其他因素

1．7 杨树转基因存在的问题和应用前景

1．8 植物功能基因筛选技术和方法

1．8．1 抑制性差减杂交技术

1．8．2 表达序列标签技术

1．8．3 蛋白质组学技术

1．8．4 基因芯片技术

1．8．5 FOX hunting system技术

1．9 立体依据及研究目的意义

1．9．1 立体依据

1．9．2 研究目的意义

2 山新杨再生体系的建立

2．1 材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 培养基

2．1．3 植物激素

2．2 实验方法

2．2．1 外植体的消毒

2．2．2 叶片外植体不定芽诱导培养基的筛选

2．2．3 不定芽的壮苗培养基的筛选

2．2．4 生根培养基的筛选

2．2．5 炼苗与移栽

2．2．6 统计指标与数据分析

2．3 结果与分析

2．3．1 外植体的消毒实验结果分析

2．3．2 最佳分化培养基筛选结果分析

2．3．3 山新杨最佳壮苗培养基的筛选结果分析

2．3．4 最佳生根培养基的筛选结果分析

2．3．5 炼苗与移栽

2．4 讨论

2．5 本章小结

3 山新杨遗传转化体系的建立

3．1 材料

3．1．1 植物材料

3．1．2 菌株及载体

3．1．3 实验试剂

3．2 实验方法

3．2．1 遗传转化方法(叶盘法)

3．2．2 遗传转化条件的优化

3．2．3 扫描电镜样品制作方法

3．2．4 透射电镜样品制作方法

3．2．5 GFP的鉴定

3．2．6 十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法提取DNA

3．2．7 CTAB法提取植物总RNA

3．2．8 探针的制备

3．2．9 Southern blot杂交实验方法

3．2．10 DNA沉淀纯化实验方法

3．2．11 Northern blot杂交实验方法

3．2．12 数据统计及分析

3．3 结果与分析

3．3．1 不同浓度的Kan对山新杨叶片再生及试管苗生根的影响

3．3．2 不同浓度的Cef对山新杨叶片分化再生的影响

3．3．3 不同菌液浓度和侵染时间对遗传转化效率的影响

3．3．4 AS对山新杨遗传转化效率的影响

3．3．5 叶龄对山新杨遗传转化效率的影响

3．3．6 其他影响因素

3．3．7 转基因植株的获得

3．3．8 Southern Blot实验结果分析

3．3．9 Northern Blot实验结果分析

3．4 讨论

3．5 本章小结

4 利用蒙古柳cDNA农杆菌表达文库获得蒙古柳FOX山新杨抗性植株及其耐盐碱性初步筛选

4．1 材料

4．1．1 遗传转化实验植物材料

4．1．2 蒙古柳FOX山新杨抗性植株离体叶片耐盐碱初步筛选实验植物材料

4．1．3 实验药品和培养基

4．2 实验方法

4．2．1 蒙古柳cDNAs农杆菌表达文库构建简介

4．2．2 遗传转化方法

4．2．3 蒙古柳FOX山新杨抗性植株的耐盐碱性初步筛选

4．3 结果与分析

4．3．1 蒙古柳FOX山新杨抗性植株的获得

4．3．2 蒙古柳FOX山新杨抗性植株耐盐碱性初步筛选实验结果

4．4 讨论

4．5 本章小结

5 综合讨论

5．1 组织培养中的玻璃化现象

5．2 组培操作过程中需注意的问题

5．3 遗传转化过程中的“嵌合”现象

5．4 遗传转化过程中植物外植体的选择

5．5 农杆菌的附着和侵入与遗传转化效率关系的思考

5．6 构建cDNA文库的重要性

5．7 FOX-Hunding-System技术在木本植物山新杨中应用的展望

结论

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

声明