水稻盐碱逆境响应锌指蛋白基因OsLOL2、OsC2HC-1的功能解析

摘要

锌指蛋白是一类重要的转录因子，由不同数目的半胱氨酸残基(C)和组氨酸残基(H)结合锌离子组成锌指结构域是锌指蛋白的重要特征。它能通过锌指结构域结合某些基因启动子区域的顺式作用元件而发挥转录调控作用。研究表明，锌指蛋白广泛参与植物对非生物胁迫的响应。目前，人们已经从水稻中分离鉴定多种与非生物胁迫反应相关的锌指蛋白基因，但它们大都属于C2H2型，对于C2HC型锌指蛋白的克隆和研究在水稻中未见报道。水稻中存在一类LSD1-Like型锌指蛋白，OsLOL2是其中一个重要的成员，研究表明OsLOL2对水稻生长及疾病抵抗起着重要作用，而对OsLOL2是否参与氧化胁迫等非生物胁迫反应则不清楚。本研究用RT-PCR技术从日本晴cDNA中克隆已知基因(AK103785、AJ620677)，前者ORF全长1020bp，编码339个氨基酸，后者ORF全长492bp，编码163个氨基酸。经BLAST比对，确定AK103785含有一个C2HC型锌指结构域，命名为OsC2HC-1;AJ620677含两个LSD1-Like型锌指结构域，已经被命名为OsLOL2，其锌指结构域非常保守，系统进化树表明与拟南芥AtLOL2基因同源性最高。Southern杂交表明OsLOL2在水稻中是双拷贝的。实时荧光定量PCR检测80mM NaCl、30mM NaHCO3胁迫处理水稻叶和根中OsC2HC-1、OsLOL2基因转录表达受其诱导显著增加，且在10mM H2O2胁迫处理下，水稻叶中的OsLOL2基因表达量明显提高。将OsC2HC-1-GFP、OsLOL2-GFP导入酵母细胞和洋葱表皮细胞，酵母细胞定位初步显示OsC2HC-1在细胞核中表达，洋葱表皮亚细胞定位进一步表明锌指蛋白OsC2HC-1、OsLOL2定位于细胞核。酵母抗性分析实验显示，在NaCl和H2O2逆境下，转OsLOL2基因酵母长势优于对照。利用小量诱导优化pGEX-6p-3-OsC2HC-1、pQE30-OsLOL2分别在宿主菌BL21及M15中原核表达条件，表明最佳诱导时间分别为4h和5h。GST-OsC2HC-1融合蛋白大量诱导纯化得到以包涵体的形式稳定存在，约为63 kDa，为制作抗体准备了条件。转OsC2HC-1-GFP基因拟南芥萌发后期抗性分析实验表明，在125mM NaCl及1，3mMNaHCO3胁迫下，过表达OsC2HC-1-GFP的拟南芥比野生型优势生长，表现出较强的盐碱抗性，说明OsC2HC-1基因与抗盐碱性有关;转OsLOL2基因拟南芥在胁迫条件下萌发率及萌发期和萌发后期抗性分析实验表明，在NaCl和H2O2胁迫下，过表达OsLOL2基因拟南芥萌发率高于野生型，在含100mM NaCl，1.5mM H2O2和3mM NaHCO3的1/2MS平板上，转基因型长势优于野生型，表明OsLOL2基因与抗盐碱及氧化性相关。利用农杆菌介导法将OsLOL2转入烟草K326和水稻龙粳11，PCR检测显示OsLOL2基因已经成功整合至烟草和水稻基因组中，为进一步解析OsLOL2基因的功能准备了材料，也为创造抗逆性烟草和水稻新品系打下基础。

目录

摘要

1 绪论

1．1 课题背景

1．2 植物转录因子

1．2．1 植物转录因子的结构与功能

1．2．2 参与非生物胁迫的植物转录因子

1．3 锌指蛋白的研究进展

1．3．1 锌指蛋白的结构特征

1．3．2 锌指蛋白的作用方式

1．4 参与非生物逆境胁迫响应的植物锌指蛋白

1．4．1 与盐胁迫相关的植物锌指蛋白

1．4．2 与低温胁迫相关的植物锌指蛋白

1．4．3 与氧化胁迫相关的植物锌指蛋白

1．5 CCHC型和LSD1型锌指蛋白的研究进展

1．6 本研究的目的和意义

2 水稻OsC2HC-1、OsLOL2基因的分离鉴定及表达特性分析

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 水稻OsC2HC-1、OsLOL2基因的克隆

2．2．2 水稻OsC2HC-1、OsLOL2基因的生物信息学分析

2．2．3 水稻OsLOL2基因的Southern杂交分析

2．2．4 逆境胁迫下OsC2HC-1基因的mRNA表达特性

2．2．5 逆境胁迫下OsLOL2基因的mRNA表达特性

2．3 本章小结

3 水稻OsC2HC-1、OsLOL2基因的亚细胞定位

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 酵母表达载体、瞬时表达载体及植物表达载体的构建和酶切鉴定

3．2．2 水稻OsC2HC-1基因在酵母及洋葱表皮细胞中的定位

3．2．3 水稻OsLOL2基因在洋葱表皮细胞中的定位

3．3 本章小结

4 水稻OsLOL2基因在酵母中的表达及抗性分析

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果与分析

4．2．1 酵母表达载体pYES2-OsLOL2的构建及酶切鉴定

4．2．2 反转录PCR鉴定重组质粒的表达

4．2．3 水稻OsLOL2基因在酵母中的抗性解析

4．3 本章小结

5 水稻OsC2HC-1、OsLOL2基因在大肠杆菌中的原核表达

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 方法

5．2 结果与分析

5．2．1 原核表达载体pGEX-6p-3-OsC2HC-1、pQE30-OsLOL2的构建及鉴定

5．2．2 重组蛋白GST-OsC2HC-1在大肠杆菌BL21中的表达及纯化

5．2．3 重组蛋白His-OsLOL2在大肠杆菌M15中的表达

5．3 本章小结

6 水稻OsC2HC-1、OsLOL2基因在拟南芥中的表达和抗性解析及OsLOL2基因对烟草和水稻的遗传转化

6．1 材料和方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果与分析

6．2．1 植物表达载体pBI121-OsC2HC-1-GFP、pBI121-OsLOL2的构建及酶切鉴定

6．2．2 转pBI121-OsC2HC-1-GFP、pBI121-OsLOL2基因拟南芥的卡那霉素抗性鉴定

6．2．3 转pBI121-OsC2HC-1-GFP、pBI121-OsLOL2基因拟南芥植株的分子检测

6．2．4 转pBI121-Osc2HC-1-GFP、pBI121-OsLOL2基因拟南芥的抗逆性分析

6．2．5 农杆菌介导法获得烟草转化子

6．2．6 转OsLOL2基因烟草的PCR鉴定

6．2．7 转OsLOL2基因水稻植株的获得

6．2．8 转OsLOL2基因水稻的PCR鉴定

6．3 本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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