东北梅花鹿茸生长期顶端组织差异表达基因的筛选和鉴定

摘要

鹿茸是哺乳动物中惟一能够再生的组织器官，因此鹿茸为哺乳动物组织器官再生的研究提供了独特的模型。研究已表明鹿茸发育属软骨内成骨，其再生基于干细胞而不涉及细胞的去分化;在鹿茸生长过程中，细胞的分化、增殖、凋亡都受到特定基因的表达调控;但其再生及其生长发育的分子机制迄今还并不十分清楚。
　　本试验采用mRNA差异显示PCR技术筛选东北梅花鹿茸生长过程中小鞍子(前期）、二杠茸（中期）和三杈茸（后期）顶端间充质组织的差异表达基因片段，共获得45条鹿茸生长过程中差异表达片段，回收了15条，其中14条克隆测序，经Blast比对发现5条序列(EST1、EST2、EST3、EST4和EST5)分别与已知基因(COL9A3、MALAT1、LOX、BCLAF1)高度同源，EST3与EST5来源于LOX基因，其它序列在数据库中均无同源基因。采用实时定量PCR进一步检测LOX基因表达水平，与mRNA差异显示结果基本一致。
　　本试验初步发现:COL9A3在鹿茸生长前期不表达，后期的表达量大于中期;MALAT1在鹿茸生长中期表达量最高，前期至中期表达上调，中期至后期表达下调;LOX在鹿茸生长中、后期的表达量大于前期;BCLAF1只在鹿茸生长的后期表达。实时定量结果显示:鹿茸间充质生长的3个时期，LOX mRNA表达水平呈上调趋势，中期表达量最高，显著高于前期(P＜0.05)，后期与前期、中期差异均不显著（P＞0.05），提示该基因参与鹿茸间充质前期至后期的生长，推测其可能促进了间充质细胞的快速增殖，协同其它因子使胶原蛋白与弹性蛋白形成分子间的交联，稳定细胞外基质，保持细胞外内环境稳定。

目录

摘要

符号说明

1 绪论

1．1 鹿茸的生长发育规律

1．1．1 鹿茸生长发育的组织结构

1．1．2 鹿茸的再生机理

1．1．3 鹿茸的组织发生

1．1．4 鹿茸的器官形成

1．2 鹿茸生长发育过程中的组织学特性

1．3 鹿茸生长发育调控

1．4 mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术简介

1．4．1 DDRT-PCR技术的原理

1．4．2 DDRT-PCR技术的发展

1．4．3 DDRT-PCR技术的优点与局限性

1．5 本研究的目的及意义

2 材料与方法

2．1 样品采集

2．2 网络资源及软件

2．3 试剂及引物

2．3．1 主要试剂及试剂盒

2．3．2 电泳所需溶液配方

2．3．3 染色溶液的配制

2．3．4 LB培养基的配制

2．3．5 mRNA差异显示PCR引物

2．4 仪器设备

2．5 试验方法

2．5．1 鹿茸间充质的获取

2．5．2 鹿茸间充质总RNA的提取

2．5．3 RNA纯化

2．5．4 cDNA的合成

2．5．5 DDRT-PCR反应

2．5．6 8％聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．5．7 银染法显色

2．5．8 差异片段的切取

2．5．9 差异片段的二次扩增

2．5．10 二次扩增产物的回收

2．5．11 PCR产物克隆

2．5．12 Real-time PCR定量分析

2．6 本章小结

3 结果

3．1 RNA纯度与完整性

3．2 mRNA差异显示结果

3．3 差异片段的回收与再扩增

3．4 再扩增产物的克隆及阳性克隆的鉴定

3．5 差异片段序列的测序及同源性分析结果

3．6 实时定量PCR结果

3．6．1 RNA纯度和完整性

3．6．2 LOX基因实时实时定量PCR扩增产物的电泳检测

3．6．3 实时定量PCR扩增曲线

3．6．4 实时定量PCR熔解曲线

3．6．5 LOX基因表达的相对定量

3．7 本章小结

4 讨论

4．1 应用改进的DDRT-PCR方法获得差异基因表达序列

4．2 差异条带的筛选

4．3 部分差异序列功能分析

4．3．1 EST1

4．3．2 EST2

4．3．3 EST3与EST5

4．3．4 EST4

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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